ICS 65.150 B 51 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1353—2013 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 Diagnostic protocols for Cryptocaryonosis of marine cultured fish 2013-08-01 发布 福建省质量技术监督局 2013-11-01 实施 发 布 DB35/T 1353—2013 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。 本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、福建省水生动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：樊海平、卓玉琛、林煜、吴斌、马平、曾占壮、钟全福、翁祖桐。 I DB35/T 1353—2013 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 1 范围 本标准规定了海水养殖鱼类刺激隐核虫病的术语与定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、 形态学及PCR诊断。 本标准适用于海水养殖鱼类刺激隐核虫病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 3 术语与定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 刺激隐核虫病 Cryptocaryonosis 俗称海水小瓜虫病，海水养殖鱼类受刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染，发生病理变化， 出现行为异常或死亡。 4 试剂与仪器 4.1 试剂与溶液 4.1.1 水：GB/T 6682，一级。 2 4.1.2 海水：压力为 1.05 kg/cm ，121.3 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 4.1.3 生理盐水。 4.1.4 固定液：4％甲醛或 70％乙醇。 4.1.5 引物： ——F1：5'-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3'，浓度 10 µmol/L，-20 ℃保存； ——R1：5'-TGAGAGAATTAATCATAATTTATAT-3'，浓度 10 µmol/L，-20 ℃保存。 4.1.6 溶菌酶（100 µg/mL）：生化试剂，-20 ℃保存。 1 DB35/T 1353—2013 4.1.7 蛋白酶 K（100 µg/mL）、NaCl（3 mol/L）、裂解缓冲液、SYBR GreenⅠ工作液按附录 A 的规 定配制。 4.1.8 DNA 分子量标准（0.1 kb～1.5 kb）：生化试剂，-20 ℃保存。 4.1.9 阳性对照：刺激隐核虫 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.1.10 阴性对照：未感染刺激隐核虫的海水鱼类 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.1.11 空白对照：无菌双蒸水为模板。 4.1.12 Giemsa 染色液：Giemsa 干粉 1 g，甘油（分析纯）66 mL，甲醇（分析纯）66 mL。将 Giemsa 干粉倒入研钵内，加少量甘油，研磨至无颗粒状，将剩余甘油倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中， 56 ℃温箱中保温 2 h，再加入甲醇混匀后贮存备用。 4.1.13 甘油（分析纯）。 4.1.14 除上述试剂与溶液外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 5 章的规定执行。 4.2 仪器与设备 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 4.2.11 4.2.12 4.2.13 光学显微镜、解剖镜和放大镜（30×）。 PCR 扩增仪：配备 25 µL 和 50 µL 的 PCR 反应底座。 凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。 电泳仪：输出直流电压 0 V～400 V，直流电流 1 mA～500 mA。 水平电泳槽：容量 250 mL～650 mL，带凝胶板、样孔梳。 台式离心机：配备 1.5 mL 转子，转速 16 000 r/min 以上。 电动研磨器：转速 500 r/min～5 000 r/min。 2 研磨棒：1.05 kg/cm 、121.3 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 2 离心管：1.5 mL，1.05 kg/cm 、121.3 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 2 PCR 反应管：25 µL 和 50 µL，1.05 kg/cm 、121.3 ℃高压蒸汽灭菌 15 min。 铜网：孔径 500 µm（32 目）。 超声波细胞破碎仪：工作频率 0 KHz～60 KHz。 除上述仪器与设备外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 6 章的规定执行。 5 流行情况与主要症状 5.1 流行情况 几乎在所有海水养殖鱼类中都可发生，主要危害大黄鱼、卵形鲳鯵、石斑鱼、真鲷、斜带髭鲷和 鮸鱼等，对苗种造成的危害大于成鱼。水温 10 ℃～30 ℃均可发生，发病时间主要为 5 月下旬～7 月中 旬（水温约为 22 ℃～28 ℃）和 9 月中旬～11 月下旬（水温约为 25 ℃～19 ℃）两季。 5.2 主要症状 病鱼游动迟缓，对外界刺激反应迟钝，呼吸困难，摄食量减少；病情严重时，病鱼离群于水面缓慢 游动，不摄食。体表、眼角膜、口腔周围和鳃可观察到白点，体表、鳍、鳃黏液增生形成白色混浊状薄 膜，病情严重时体表出现点状出血。 6 样品采集与处理 6.1 采样 2 DB35/T 1353—2013 从同一个养殖网箱或池塘中采集具有临床症状的鱼体，全长小于 5 cm 的为 10 尾，全长大于或等于 5 cm 的为 5 尾，其余按 SC/T 7014-2006 第 6 章的规定执行。 6.2 样品封存、运输、登记与保存 按SC/T 7103-2008第9章、第10章、第11章和12章的规定执行。 7 形态学诊断 7.1 显微镜检查 2 2 刮取不小于2 cm 的体表黏液、剪取0.5 cm 以上的尾鳍和左右鳃的第2鳃瓣的鳃丝，分别置于洁净载 玻片上，加适量海水，制作水封片，在10×10的低倍镜下观察到卵圆形、大小为（0.066 mm～ 0.45 mm）×（0.034 mm～0.36 mm），全身纤毛做旋转运动的虫体，有时可见虫体内含“U”形大核。 7.2 病原体确认 刮取体表或鳃的白点，于装有海水的培养皿中静置，在解剖镜或放大镜下吸取虫体，用4％甲醛或 70％乙醇固定过夜， 吸取虫体涂于载玻片， 常温干燥后，Giemsa染液染色30 s，2倍～3倍双蒸水浸洗2 min， 再水洗，常温干燥，甘油封片，显微镜观察虫体形态，参照附录B确认。 7.3 诊断 检测样品主要症状与5.2描述相符，病原体确认虫体为刺激隐核虫，其中有一个样片在一个视野中 观察到不少于3个虫体，即可诊断患刺激隐核虫病。 8 PCR 诊断 8.1 样品准备 全长小于 5 cm 的鱼体，采集后立刻放入 70％乙醇固定过夜后，将固定的样品剪碎，电动研磨器 5 000 r/min 研磨 10 min 至匀浆状，加生理盐水于 500 µm 的铜网中过滤，滤液 10 000 r/min 离心 5 min， 取沉淀物备用。 8.2 DNA 的提取 取50 mg沉淀物，加180 µL裂解缓冲液溶解后，加20 µL蛋白酶K混匀，55 ℃裂解2 h，其间用电动 研磨器5 000 r/min研磨5 min或超声波破碎样品40 KHz破碎10 s；裂解样品16 000 r/min离心10 min， 取上清液于1.5 mL离心管中；加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀8 min，16 000 r/min离心 10 min，取上层液体于1.5 mL离心管中；加1/10体积的3 mol/L NaCl，2.5体积的无水乙醇，颠倒混匀 5 min，-20 ℃放置30 min，16 000 r/min离心10 min，弃上清液；加70％乙醇500 µL重悬沉淀， 16 000 r/min离心5 min，弃上清液；室温下干燥10 min；加TE缓冲液30 µL，-20 ℃保存备用。 8.3 PCR 扩增 8.3.1 反应体系的准备 PCR反应可选择25 µL或50 µL反应体系进行。按表1的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，配制成 无酶反应预混物。按检测PCR反应体系1份/支或100份/支分装，-20 ℃保存。临用前，根据所需的反应 3 DB35/T 1353—2013 份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的Taq酶和待测样品模板混匀，按1份/支分装到0.2 mL PCR 管中。 表1 PCR 反应所需试剂组成 试 剂 25 µL 反应体系 50 µL 反应体系 试剂终浓度 10×PCR 缓冲液 2.5 µL 5.0 µL 1× 氯化镁（25 mmol/L） 3.0 µL 6.0 µL 3 mmol/L dNTP （10 mmol/L） 1.0 µL 2.0 µL 200 µmol/L 引物 F1（10 µmol/L） 0.5 µL 1.0 µL 0.08 µmol/L 引物 R1（10 µmol/L） 0.5 µL 1.0 µL 0.08 µmol/L 灭菌双蒸水 16.4 µL 32.8 µL — TaqDNA 聚合酶（5 U/µL） 0.1 µL 0.2 µL 0.02 U/µL 1 份反应总体积 25.0 µL 50.0 µL — 100 份反应总体积 250.0 µL 500.0 µL — 注：每25.0 µL体系模板量1.0 µL；每50.0 µL体系模板量2.0 µL。 8.3.2 扩增程序 8.3.2.1 按照表 1 各反应体系所需的模板体积要求，在含有反应物的 PCR 管中分别加入相应体积的各 样品 DNA 模板。并设阳性对照、阴性对照和空白对照。每个样品制备 3 个平行样。 8.3.2.2 将含有反应物的 PCR 管置于 PCR 仪反应槽中，按以下程序扩增：94 ℃预变性 5 min，（94 ℃ 变性 30 s，54 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 1.5 min）×35 个循环，72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存备用。 8.4 琼脂糖凝胶的制作 8.4.1 用 1×电泳缓冲液配制 1％的琼脂糖凝胶，加热至溶液完全透明。 8.