ICS 11.120.20 C 30 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5127.12—2019 植入性医疗器械 高分子材料 浸提液中 有毒有害物质的测定 第 12 部分：异氰酸酯 迁移量 高效液相色谱法 2019 - 12 - 27 发布 河北省市场监督管理局 2020 - 01 - 28 实施 发 布 DB13/T 5127.12—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 DB13/T 5127《植入性医疗器械 高分子材料 浸提液中有毒有害物质的测定》共分16个部分： ——第1部分：柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾迁移量 原子吸收分光光度法； ——第2部分：二巯基丙醇迁移量 碘量法； ——第3部分：葡萄糖迁移量 碘量法； ——第4部分：柠檬酸迁移量 酸碱中和滴定法； ——第5部分：硫氰酸胍迁移量 分光光度法； ——第6部分：丙酮迁移量 气相色谱法； ——第7部分：丙交酯迁移量 气相色谱法； ——第8部分：对苯二甲酸迁移量 高效液相色谱法； ——第9部分：乙醇迁移量 气相色谱法； ——第10部分：环氧乙烷迁移量 气相色谱法； ——第11部分：戊二醛迁移量 高效液相色谱法； ——第12部分：异氰酸酯迁移量 高效液相色谱法； ——第13部分：甲醛迁移量 气相色谱质谱联用法； ——第14部分：蛋白质迁移量 可见-紫外分光光度法； ——第15部分：铅、砷、镉、铬、铜、锑、钡、铝、锌、锡迁移量 电感耦合等离子体质谱法； ——第16部分：生物负载 薄膜过滤法。 本部分为DB13/T 5127的第12部分。 本部分由河北省药品监督管理局提出并归口。 本部分起草单位：河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院、石家庄市中医院。 本部分主要起草人：刘若锦、韩琳、王丽、刘华、杨光。 I DB13/T 5127.12—2019 植入性医疗器械 高分子材料 浸提液中有毒有害物质的测定 第 12 部分：异氰酸酯迁移量 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了植入性医疗器械高分子材料浸提液中异氰酸酯迁移量的高效液相色谱法的测定方 法。 本标准适用于植入性医疗器械高分子材料浸提液中异氰酸酯迁移量的测定。 本方法各异氰酸酯最低检测限均为0.02 mg/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 16886.12 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料 3 方法原理 试样经二氯甲烷提取后，与9-甲氨基甲基蒽进行衍生反应，衍生产物采用高效液相色谱柱分离， 荧光检测器进行测定，外标法定量。 4 试剂与材料 除另有规定，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 甲苯－2,6－二异氰酸酯：CAS 91-08-7，纯度＞99 %。 4.2 二苯基甲烷－4,4’－二异氰酸酯：CAS 101-68-8，纯度＞99 %。 4.3 甲苯－2,4－二异氰酸酯：CAS 86-91-9，纯度＞99 %。 4.4 萘－1,5－二异氰酸酯：CAS 3173-72-6，纯度＞99 %。 4.5 苯基异氰酸酯：CAS 103-71-9，纯度＞99 %。 4.6 环己基异氰酸酯：CAS 822-06-0，纯度＞99 %。 4.7 9－甲氨基甲基蒽：纯度＞99 %。 4.8 二氯甲烷：5Å 分子筛干燥过夜，备用。 4.9 乙醚，纯度≥99 %。 1 DB13/T 5127.12—2019 4.10 磷酸，AR。 4.11 乙腈：色谱纯。 4.12 N，N－二甲基甲酰胺，纯度＞99 %。 4.13 三乙胺溶液（3 %，v/v）。 5 试剂配制 5.1 缓冲溶液：在 1 L 容量瓶中，加入 950 mL 3 %三乙胺溶液（4.13），用磷酸调节 pH 值至 3.0， 用水定容。 5.2 衍生化试剂（260 mg/L）：称取 9－甲氨基甲基蒽（4.7）0.013 g（精确到 0.1 mg），用二氯甲 烷（4.8）溶解并转移至 50 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容，避光保存。此溶液现用现配。 5.3 衍生物溶剂：量取 50 mL N，N－二甲基甲酰胺（4.12）于 100 mL 容量瓶中，加入 40 mL 乙腈（4.11）， 用水定容。 5.4 异氰酸酯储备液（1 000 mg/L）：称取各种异氰酸酯标准物质（4.1～4.6）0.01 g（精确到 0.1 mg），二氯甲烷（4.8）溶解后转移至 10 mL 容量瓶中，二氯甲烷定容。可以采用超声波加速溶解。储 备液-20℃避光干燥保存，有效期为 1 个月。 5.5 异氰酸酯标准中间液（100 mg/L）：分别量取 5 mL 二氯甲烷（4.8）于 6 个 10 mL 容量瓶中，分 别移入 1.0 mL 各种异氰酸酯储备液（5.4），针头应伸入液面以下，二氯甲烷定容。标准中间液-20℃ 避光干燥保存，有效期为 1 个月。 5.6 异氰酸酯标准工作液（1 mg/L）：分别量取 5 mL 二氯甲烷（4.8）于 6 个 10 mL 容量瓶中，分别 移入 100L 各异氰酸酯标准中间液（5.5），针头应伸入液面以下，二氯甲烷定容，混匀。标准工作 液-20℃避光干燥保存，有效期为两周。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱：配置荧光检测器。 6.2 色谱柱：C18 柱，150mm×4.6mm,粒度 5μ m 或相当者。 6.3 电子天平：精度 0.1 mg。 6.4 涡旋混合器。 6.5 氮吹仪。 6.6 离心机。 6.7 玻璃瓶，20 mL 或其他合适体积者。配有铝制密封瓶帽和内表层覆盖有聚四氟乙烯膜的气密性优 良的丁基橡胶或硅橡胶垫。 6.8 带针头的注射器，5μ L、10μ L、50μ L、100μ L、1000μ L。 6.9 0.45 µm 微孔滤膜。 2 DB13/T 5127.12—2019 6.10 pH 计。 7 试液制备 7.1 浸提溶液 本标准采用模拟浸提方式，分别以生理盐水和橄榄油为浸提介质。 7.1.1 浸提条件和方法 7.1.2.1 浸提条件建立在通常可行并经论证为一个标准化方法的基础之上，在多数情况下为产品使用 的适当加严的条件。应在下列之一的条件下进行浸提： a) (37±1)℃,(24±2) h； b) (37±1)℃,(72±2)h； c) (50±2)℃,(72±2) h； d) (70±2)℃,(24±2) h； e) (121±2)℃,(1±0.1)h。 7.1.2.2 可用标准表面积确定所需的浸提介质的体积。标准表面积包括样品两面面积的总和，不包括 不确定和不规则面积。当由于样品外形不能确定其表面积时，应使用质量/浸提液体积。见表1。 表1 标准表面积和浸提液体积 厚度 浸提比例 （mm） （表面积或质量/体积）±10% 膜、薄片、管壁 ＜0.5 6 cm / mL 管壁、厚板、小型模制件 0.5～1.0 3 cm / mL 大型模制件 ＞1.0 3 cm / mL 弹性密封件 ＞1.0 1.25 cm / mL 粉剂、球体、泡沫材料、无吸收性模制件 不规则形状固体器械 0.2 g/ mL 薄膜、织物 不规则形状多孔器械（低密度材料） 0.1 g/ mL 材料形态举例 2 2 2 2 注1：现在尚无测试吸收剂和水胶体的标准化方法，推荐以下方案： 2 注2：测定材料浸提介质吸收量（每0.1 g或1.0cm 材料所吸收的量）； 2 注3：在进行浸提时，对浸提混合物按每0.1 g或1.0 cm 额外加入该浸提介质吸收量。 7.1.2.3 对于弹性体、涂层材料、复合材料、多层材料等，由于完整表面与切割表面存在潜在的浸提 性能差异，因此应尽量完整地进行浸提。 7.2 浸提液处理 移取1 ml浸提液，放入20 ml小瓶中，加入10 mL二氯甲烷（5.8）和1 ml衍生试剂，密封，避光， 振荡12 h，提取液转移至另一20 ml小瓶中，氮气浓缩到2 ml左右。将玻璃瓶密封，并在-20℃条件下 保存。在提取过的试样中，再加入10 mL二氯甲烷,将瓶口密封，振荡12 h。合并提取液，氮气浓缩蒸 发至干。加入10 mL的衍生物溶剂，超声溶解，将溶液通过0.45 μ m滤膜过滤，待上机测定。平行制样 两份。 注：衍生化试剂对光敏感，提取、衍生过程应在避光条件下进行。 7.3 标准工作液制备 3 DB13/T 5127.12—2019 取6个20 mL玻璃小瓶中，分别加入10 mL二氯甲烷、1 mL衍生试剂和1 mL各浓度混合标准工作液， 各异氰酸酯浓度浓度分别为0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L，以下 提取步骤按照6.2进行。 7.4 空白液制备 以同批浸提介质作为空白试验液。 8 测定 8.1 仪器参考条件 根据所用仪器选用最佳测定条件。 参考条件：流动相：A为乙腈；B为缓冲溶液，洗脱梯度见表2； 表2 洗脱梯度表 时间（min） A（%） B（%） 0 70 30 25 80 20 30 70 30 流速：1 mL/min；激发波长：254 nm，发射波长：412 nm；柱温：40℃；进样量：20 μL。 8.2 衍生物色谱峰确认 分别吸取100 L各异氰酸酯标准中间液于6个玻璃瓶中，加入1 mL衍生化试剂，密封，避光反应 30 min，氮气浓缩至干，再加入10 mL衍生物溶剂，混匀，按照7.1仪器参考条件测定，确定各衍生物 的保留时间。 8.3 标准曲线绘制 按照8.1仪器参考条件对标准工作液进行测定，以试样中各异氰酸酯浓度为横坐标，以各异氰酸酯 衍生物色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性方程。 8.4 样品测定 按照8.1仪器参考条件，根据各异氰酸酯衍生物保留时间，确定试样中异氰酸酯的种类，得到各异 氰酸酯衍生物色谱峰峰面积。 浸提液中异氰酸酯参考色谱图见附录A。 9 结果计算 浸提液中单个异氰酸酯的含量按公式（1）计算。 ………………………………………………………（1） 式中： C ——浸提液中异氰酸酯的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； 4 DB13/T 5127.12—2019 y ——浸提液中异氰酸酯衍生物的峰面积； a ——回归曲线的斜率； b ——回归曲线的截距； ρ ——稀释倍数。 样品中单个异氰酸酯的特定迁移量按公式（2）计算。 M  C A  1000 ………………………………………………（2） 式中：