ICS 11.220 B 50 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3399—2019 水产动物病原菌药敏试验和耐药性 检测技术规范 Standard for Drug sensitivity test and drug resistance test of aquatic pathogenic bacteria 文稿版次选择 2019 - 11 - 04 发布 安徽省市场监督管理局 2019 - 12 - 04 实施 发 布 DB34/T 3399—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省水产技术推广总站、定远县水务局、明光市水产技术推广 站、蒙城县畜牧兽医水产局、安徽海辉水产养殖有限公司、宁国市渔业渔政管理局、定远县海群现代农 业发展有限公司、绩溪县农业委员会水产站、望江县水产局、阜南县水产管理局。 本标准起草人：彭开松、吴敏、姜守松、范文鲁、赵祖芳、王黎明、贾俊威、付成海、薛贵胜、朱 若林、鲍传和、蒋军、魏泽能、檀基良、曹学志、于朝敏。 I DB34/T 3399—2019 水产动物病原菌药敏试验和耐药性检测技术规范 1 范围 本标准规定了淡水水产动物病原菌药敏试验和耐药性检测的术语与定义、样品采集、病原菌分离与 鉴定、纸片扩散法测定抑菌圈直径、微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度、病原菌耐药性检测。 本标准适用于淡水水产动物病原细菌药敏试验和耐药性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 27623.1 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分:常量肉汤稀释法药物敏感性试验 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求 3 术语和定义 下述术语和定义适用于本文件。 3.1 活水产动物 Live aquatic animals 具有典型症状和大体病变的活水产动物。 3.2 冻水产动物 Frozen aquatic animals 活水产动物断头处死后装入无菌塑料自封袋，在 -20℃冻存 6 h～12 h 的水产动物。 3.3 冰水产动物 Ice aquatic animals 活水产动物断头处死后装入无菌塑料自封袋，在湿冰中存放 6 h～12 h 的水产动物。 3.4 死水产动物 Dead aquatic animals 死后在养殖水体中留存 6 h～12 h 的水产动物。 4 样品采集 1 DB34/T 3399—2019 4.1 采样器材 手术剪，镊子，解剖盘，无菌棉试子，无菌塑料自封袋，保温采样箱，乳胶手套，网具。 4.2 样品数量 具有典型临床症状和大体病变的患病水产动物 3～5 尾作为分离病菌的样品。如果症状和大体病变 复杂，可以适当增加样品数量。 4.3 样品质量 样品质量优劣次序为：活水产动物＞冰水产动物＞冻水产动物＞死水产动物。无法获得前三种样品 时，可使用死水产动物。样品数量多或动物个体大时，用无菌棉试子充分吸收样品中的体液或直接蘸取 小块组织，保存于采样管。样品在 4℃保温箱或冰盒中运送。 5 病原菌分离与鉴定 5.1 样品处置时限 送检样品到达实验室后应立即处理，不能存放过夜。 5.2 分离培养基 根据疑似病菌类别，选择预制好的分离培养基（参见附录A和附录B）。 5.3 病原菌分离 5.3.1 内脏器官分离法 全身系统性感染病例，体表经 75％酒精消毒后，剪除腹壁（鱼类、两栖类、爬行类）或剥离甲壳 （虾、蟹和贝类），暴露腹腔或甲壳下的脏器。无菌摘下肝胰腺或脾脏或肾脏，剪一断面涂布到固体培 养基表面，划线法分离病菌。 5.3.2 体表损伤组织接种法 体表或鳃局灶性损伤病例，选新鲜病灶，在损伤与健康组织的交界处,无菌刮取采集约 1 μL 的样 品，接种到固体培养基表面，划线法分离病菌 5.4 病原菌物种鉴定 利用形态学、生理生化特性和 16SrDNA 测序等鉴定分离菌。 5.5 病原菌致病性鉴定 经毒力基因检测和本动物回归攻毒试验，确定分离菌的致病性。 6 纸片扩散法测定抑菌圈直径 6.1 试验器材 纸片扩散法所需试验器材应符合 WS/T 639 的规定。 2 DB34/T 3399—2019 6.2 培养基制备 根据细菌鉴定结果，选择相应固体培养基（见附录D），固体培养基厚度为 4 mm ± 0.5 mm。固体 培养基用无菌塑料自封袋密封后，可在 4～8℃放 7～14 天，用前在 37℃温箱中除明水。 6.3 试验菌液制备 测 试 菌 株 包 括 临 床 分 离 病 原 菌 和 质 控 参 考 菌 株 （ 大 肠 杆 菌 ATCC25922 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 8 ATCC29213）。过夜培养的测试菌株用灭菌生理盐水稀释为 0.5 麦氏浊度（相当于 1～2×10 cfu/mL）， 在 15～60 min 内用完。 6.4 试验操作过程 灭菌棉试子蘸取上述菌悬液均匀涂布在琼脂表面。在 15 min 之内，将药敏纸片（见附录C）均匀 平坦紧贴到平板上（纸片中心间距离至少 3 cm）。倒置平板并在 15 min 内放到培养箱培养,培养皿叠 放不超过 5 层。培养温度和时间见附录D。 6.5 试验结果判定 培养结束，取出培养皿，放在眼前 30 cm 处，测量抑菌圈直径（单位为 mm）。根据折点值（参 见附录E），判断敏感性。如果在培养皿表面仅见单菌落，说明接种量不够，要重新进行试验。 7 7.1 微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度 试验器材 除将试管替换为 96 孔微量培养板外，其余所需试验器材应符合 GB/T 27623.1 的规定。 7.2 培养基制备 根据细菌鉴定结果，选择相应肉汤培养基（附录D）。 7.3 抗菌药物溶液制备 抗菌药物批号、效价、有效期和存储条件，必须明确，并按要求存放在 4～8℃的干燥器内。使用 药物储存液配制溶剂（附录C）溶解抗菌药物，制备浓度高于 1 g/L 的抗菌药物储存液，抗菌药物储备 液在 -20℃可保存一个月。使用药物工作液配制溶剂（附录C）稀释抗菌药物储存液，制备所需的 2 倍 比稀释的抗菌药物工作液，并在一天内用完 7.4 细菌工作液制备 过夜培养的测试菌株先用灭菌生理盐水稀释为 0.5 麦氏浊度，再用肉汤稀释 100 倍，使细菌工作 6 液浓度约为 1×10 cfu/mL。细菌工作液最好在 30 min 内用完，否则应存放在冰上。 7.5 试验操作过程 给 96 孔微量培养板做好标记。第 A～H 行，每两行为一个重复。第 1～10 列为测试孔，加入对 应浓度的 2 倍比稀释的抗菌药物工作液，每孔 100 μL。第 11 列为阳性对照孔，第 12 列为阴性对照 孔，二者均加 100 μL 灭菌生理盐水。第 1～11 列加细菌工作液 100 μL；第 12 列加肉汤 100 μL。 上述布板完成后，立即从阳性对照孔中取 10 μL 菌悬液加到 10 mL 的生理盐水中，混匀后取 100 μL 3 DB34/T 3399—2019 涂布到相应固体培养基表面（见附录D），过夜培养后计数。加盖微量培养板用无菌塑料自封袋密封后， 放入培养箱中孵育（培养温度和时间，见附录D）。微孔板的叠层不超过 5 层。 7.6 试验结果判定 如果 7.5 中计数的每个培养皿中菌落数量在 20～80 之间，则说明细菌工作液浓度比较合适。 细 菌平板计数和结果认定方法参照 GB 4789.2。微量培养板培养结束后，必须同时满足阳性对照孔浑浊且 阴性对照孔清亮，试验结果才有效；否则，试验应重做。以清亮测试孔对应的最小药物工作液终浓度为 最小抑菌浓度（MIC）。 8 病原菌的耐药性检测 8.1 纸片扩散法 抑菌圈直径小于耐药性折点直径(附录E)，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。 8.2 最小抑菌浓度法 最小抑菌浓度大于耐药性折点浓度(附录E)，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。 8.3 MBC/MIC 比值法 最小抑菌浓度（MIC）结果读取结束后， 取 MIC 孔之前清亮孔的各孔培养物 100 μL，进行细菌 平板计数。当 7.5 中阳性对照孔计数结果为某清亮孔计数结果的 1000 倍时，该清亮孔所对应的药物 浓度就是最小杀菌浓度（MBC）。当 MBC/MIC≥32 时，可判定该菌对某种药物有耐药性。 4 DB34/T 3399—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂和培养基 A.1 灭菌生理盐水 8.5g NaCl,1L水，121℃、15min高压蒸汽灭菌，备用。 A.2 牛心脑浸出液琼脂（BHIA） 20 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，10 g 牛心浸粉，4 g 葡萄糖，5 g Na2HPO4，15 g 琼脂，1 L 水， pH 7.4，121℃、15 min 高压蒸汽灭菌，倾倒平板。 A.3 水解酪蛋白（Meller-Hinton）肉汤(MHB) 1 g 牛肉粉，1.5 g 可溶性淀粉，17.5 g 酸水解酪蛋白，1 L 水，pH 7.4，121℃、15 min 高压 蒸汽灭菌。灭菌前在 MHB 基础上，添加 15 g 琼脂，灭菌后倾倒平板，即为水解酪蛋白（Meller-Hinton） 琼脂（MHA）。 A.4 TYEA 1.4 g 胰蛋白胨，0.4 g 酵母膏，0.5 g MgSO4•7H2O，0.5 g CaCl2•H2O，10 g 琼脂，1 L 水，pH 7.2，121℃、15 min 高压蒸汽灭菌，倾倒平板。 A.5 Cytophaga 琼脂 0.5 g 胰蛋白胨，0.5 g 酵母膏，0.5 g 醋酸钠，0.2 g 牛肉膏，10 g 琼脂，1 L 水，pH 7.2， 121℃、15 min 高压蒸汽灭菌, 倾倒平板。 A.6 Middle-brook-ADH-enrichment-added Middle brook 7H11 0.5 g (NH4)2SO4，1.6 g KH2PO4，1.4g Na2HPO4，0.4 g 柠檬酸钠，0.05 g MgSO4，1.0 g 胰酪 蛋白胨，0.001 g ZnSO4，0.001 g CuSO4，0.5g L-谷氨酸钠，0.04 g 柠檬酸铁铵，0.001g 盐酸吡哆 醇，0.5 mg 生物素，0.25 mg 孔雀石绿。取