ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1872—2019 鸭 3 型腺病毒病诊断技术 Diagnostic technique for duck adenovirus 3 infection 2019 - 12 - 19 发布 福建省市场监督管理局 2020 - 03 - 19 实施 发 布 DB35/T 1872—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 缩略语 ............................................................................ 1 3 疫病概述 .......................................................................... 1 4 临床诊断 .......................................................................... 1 5 PCR 诊断........................................................................... 1 6 结果判定 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 试剂的配制 ...................................................... 4 附录 B（资料性附录） PCR 检测结果电泳图 .............................................. 6 附录 C（资料性附录） 参考序列 ........................................................ 7 I DB35/T 1872—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、李中华、程龙飞、刘荣昌、施少华、陈翠腾、陈红梅、 傅秋玲、陈珍、朱春华。 II DB35/T 1872—2019 鸭 3 型腺病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭3型腺病毒病的临床诊断、PCR诊断和结果判定。 本标准适用于鸭3型腺病毒病的临床诊断、实验室诊断和流行病学调查。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DAdV-3：鸭3型腺病毒（Duck Adenovirus 3） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline） Tris：三羟甲基氨基甲烷（Trihydroxymethyl Aminomethane） 3 疫病概述 根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses）的最新分类： 腺 病 毒 科 （ Adenoviridae ） 下 设 5 个 属 ， 分 别 为 富 AT 腺 病 毒 属 （ Atadenovirus ） 、 禽 腺 病 毒 属 （Aviadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和唾液 酸酶腺病毒属（Siadenovirus）。 鸭3型腺病毒病主要发生于40日龄内雏番鸭，临床表现为肝脏肿大、出血，脾脏肿大，胆囊肿大， 肾脏肿大、出血。流行病学调查表明，该病发病率20%～50%，病死率60%～70%。 4 临床诊断 4.1 剖检病变 当鸭出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 肝脏肿大，表面呈点状或斑状出血； b) 脾脏肿大； c) 胆囊肿大； d) 肾脏肿大，表面出血。 4.2 初步诊断 当鸭出现4.1中剖检病变之一时，可做出初步诊断；确诊需进行实验室诊断。 5 PCR 诊断 5.1 主要仪器设备 主要仪器设备如下： 1 DB35/T 1872—2019 a) b) c) d) e) f) g) PCR 仪； 高速台式冷冻离心机； 微量移液器； 组织匀浆器； 电泳仪； 电泳槽； 紫外凝胶成像系统。 5.2 试剂 主要试剂如下： a) 10%十二烷基硫酸钠（配置方法按照附录 A 中 A.1 的规定）； b) 蛋白酶 K（10 mg/mL）（配置方法按照附录 A 中 A.2 的规定）； c) 异丙醇； d) Tris·饱和酚； e) 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）； f) 乙酸钠（3 mol/L，pH5.4）； g) 无水乙醇； h) 75%乙醇（配置方法按照附录 A 中 A.3 的规定）； i) 核糖核酸酶（20 mg/mL）； j) 灭菌双蒸水； k) PBS（0.01 M）（配置方法按照附录 A 中 A.4 的规定）。 5.3 引物 根据DAdV-3的Fiber 2基因设计特异性引物，序列如下： 上游引物DAdV-3F：5’-ACACTAGACAACGGAGGCCT-3’。 下游引物DAdV-3R：5’-AATCTTGATACGTAATCATACACA-3’。 预期目的片段大小为548 bp。 5.4 核酸 DNA 提取 5.4.1 酚氯仿法提取核酸 DNA 5.4.1.1 取 2 g 组织（肝脏、脾脏、肾脏或三者混合物），加入 6 mL PBS（0.01M）进行研磨处理， 反复冻融 3 次，4 000 r/min 离心 15 min，小心吸取上层水相作为组织匀浆液。 5.4.1.2 取 420 μL 组织匀浆液和 30 μL 核糖核酸酶加入 1.5 mL 灭菌离心管混匀后， 室温作用 20 min。 5.4.1.3 加入 40 μL 10%的十二烷基磺酸钠溶液和 10 μL 蛋白酶 K 溶液，56 ℃水浴 2 h。 5.4.1.4 加入等量的 Tris·饱和酚，颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小心吸取上层水相于 另一 1.5 mL 灭菌离心管中。 5.4.1.5 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小 心吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。 5.4.1.6 加入 1/10 体积的乙酸钠和 2 倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后， -20 ℃放置 1 h。 12 000 r/min 离心 15 min，去上清。加入 600 μL 冰冻预冷的 75%乙醇清洗 2 次，倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。 加入 20 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 ℃放置备用。 2 DB35/T 1872—2019 5.4.2 试剂盒法提取核酸 DNA 可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒，按照说明书完成核酸DNA提取。 5.5 对照 以纯化的DAdV-3基因组DNA为阳性对照；以灭活的其他鸭源病毒基因组DNA为阴性对照；以灭菌双蒸 水为空白对照。 5.6 PCR 扩增 5.6.1 PCR 反应体系为 50 μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入 5 μL 10×PCR 缓冲液，1 μL 上/下游引物（引物浓度均为 20 μM）、4 μL dNTP Mixture（各 2.5 mM）、2 μL 提取的基因组 DNA、 36.5 μL 灭菌双蒸水、0.5 μL Taq 聚合酶。2 000 r/min 离心 15 s。将上述反应混合液按照以下步骤 进行 PCR 扩增，94 ℃预变性 5 min；循环参数为 94 ℃变性 50 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s， 循环 35 次；第三步 72 ℃再延伸 10 min 结束。 5.6.2 也可采用市售商品化的等效 PCR 预混液检测试剂盒，并按照市售商品化的试剂盒推荐的条件进 行。 5.7 PCR 产物电泳 PCR扩增反应结束后，PCR反应管在电泳鉴定前可置于2 ℃～8 ℃冰箱保存。分别取5 μL PCR扩增 产物与0.5 μL 10×加样缓冲液（配置方法按照附录A中A.5的规定）混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶 （配置方法按照附录A中A.6的规定）板的加样孔中，加上DNA分子量标准5 μL，以5 V/cm的电压进行 电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果。 6 结果判定 6.1 实验成立的条件 当阳性对照出现约548 bp的特异性条带（参见附录B图B.1中1号泳道）、阴性对照无扩增条带（参 见附录B图B.1中2号泳道），空白对照无扩增条带（参见附录B图B.1中3号泳道），实验结果成立。 6.2 实验结果判定 当待检样品出现约548 bp条带（参见附录B图B.1中4号泳道），可判定为阳性；当待检样品无特异 性扩增条带（参见附录B图B.1中5号泳道）判为阴性。必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待 测样品的测序结果和参考序列（参见附录C）进行核苷酸同源性比较，同源性在98.0%以上判为阳性。 3 DB35/T 1872—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 10%十二烷基硫酸钠 将10 g十二烷基硫酸钠溶于80 mL灭菌双蒸水中，调节溶液的pH值至7.2，定容至100 mL，室温保存 备用。 A.2 蛋白酶K（10 mg/mL） 将蛋白酶K（20 mg/mL）和灭菌水按照体积比1:1配置，使用前现用现配。 A.3 75%乙醇 取无水乙醇750 mL加入灭菌双蒸水250 mL，定容至1 000 mL，-20 ℃保存备用。 A.4 PBS（0.01 M） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4·12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 5 将上述试剂溶于800 mL灭菌双蒸水中，定容至1 000 mL，1.034×10 Pa高压灭菌30 min，4 ℃保 存备用。 A.5 10×加样缓冲液 聚蔗糖 溴酚蓝 二甲苯青 灭菌双蒸水 25 g 0.1 g