(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211063321.7 (22)申请日 2022.08.31 (71)申请人 复旦大学附属中山医院青浦分院 （上海市青浦区中心医院） 地址 201799 上海市青浦区公园东路1 158 号 (72)发明人 彭媛媛　张瑞霖　刘海波　 (74)专利代理 机构 上海元好知识产权代理有限 公司 31323 专利代理师 贾慧琴　包姝晴 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 21/84(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制 片方法及成像方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于完整厚生物组织高 分辨成像的制片方法及成像方法， 所述制片方法 包括： S1， 取一块盖玻片放置在第一载物片上， 用 胶带覆盖两者； S2， 挖去盖玻片区域范围内覆盖 的胶带， 用疏水介质处理挖开区域的边缘； S3， 将 待观察的组织样品转移至盖玻片上， 吸干样品液 体， 滴加抗荧光淬灭剂静置后， 吸干样品溶剂， 滴 加凝胶， 使样品固定在盖玻片上； S4， 取下盖玻 片， 放置在第二载物片上， 使组织样品位于盖玻 片和第二载物片之间， 通过胶带将 盖玻片与第二 载物片固定连接， 完成制片。 本发明能在保持组 织完整性的同时， 高分辨的观 察特定细胞在厚组 织内部的分布和数量， 且制备方法简单， 不受光 路、 尺寸等限制， 适用于大多数正置或倒置显微 镜。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 115219308 A 2022.10.21 CN 115219308 A 1.一种用于 完整厚生物组织高分辨成像的制片方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1， 取一块盖玻片放置在第一载物片上， 用胶带覆盖所述的盖玻片和第一载物片； S2， 挖去盖玻片区域范围内覆盖的胶带， 暴露大部分盖玻片， 使用疏水介质处理挖开区 域的边缘； S3， 将待观察的组织样品转移至盖玻片上， 吸干样品液体， 滴加抗荧光淬灭剂， 静置1～ 3h后， 再次吸干样品溶剂， 滴加凝胶， 使样品固定在盖玻片上； S4， 取下盖玻片， 放置在第二载物片上， 使所述的组织样品位于盖玻片和第二载物片之 间， 通过胶带将盖玻片四周与第二载物片固定连接， 完成制片。 2.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制 片方法， 其特征在于， 所述 的组织样品的厚度为280～480 μm。 3.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制 片方法， 其特征在于， 步骤 S1中， 根据组织样品的厚度， 覆盖一层至多层胶带， 所述的胶带的总厚度不超过 组织样品的 厚度。 4.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制 片方法， 其特征在于， 步骤 S2中， 还包括： 使用疏 水介质将挖开区域内的盖玻片分成多个样品室。 5.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制 片方法， 其特征在于， 步骤 S3中， 所述的凝胶为低熔点 琼脂糖。 6.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制 片方法， 其特征在于， 步骤 S4中， 胶带固定时， 保证所述盖玻片与第二载物片之间的高度保持一 致。 7.一种完整厚生物组织的高分辨成像方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)获取待观察的样品组织， 采用权利要求1所述的制片方法制得玻片样本； (2)将所述的玻片样本水平放在显微镜载物台上， 滴加镜头所需介质， 浸润镜头， 对样 品组织进行观察。 8.如权利要求7所述的完整厚生物组织的高分辨成像方法， 其特征在于， 所述的显微镜 包括： 正置 激光共聚焦显微镜、 倒置 激光共聚焦显微镜 。 9.如权利要求8所述的完整厚生物组织的高分辨成像方法， 其特征在于， 所述显微镜采 用40倍水镜 。 10.如权利要求9所述的完整厚生物组织的高分辨成像方法， 其特征在于， 使用正置激 光共聚焦显微镜进行观察时， 在滴加介质水之前， 还 包括以下操作： 使用疏水介质在所述盖玻片上圈出介质加入区域， 所述的介质加入区域覆盖样本组 织。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115219308 A 2一种用于完 整厚生物组织高分辨成像的制片方 法及成像方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 生物组织显微观察领域， 具体涉及一种用于完整厚生物组织高分辨成 像的制片方法及成像方法。 背景技术 [0002]在生命科学研究和临床病理学分析 中， 对一定厚度范围内的组织整体进行高分辨 的成像， 可以直观的发现组织中特定类群细胞的数量和排列以及目标蛋白的表达差异等规 律， 从而辅助揭示疾病发生发展的原因。 然而， 目前对较厚的组织样品进行研究时， 通常采 用以下方法： [0003](1)对较厚的组织进行透明化处理， 然后使用光片显微镜进行成像。 然而光片显微 镜较贵， 且样品制备 过程复杂， 适 合对体积更 大的组织或者样品进行成像； [0004](2)将组织进行切片， 切成5 ‑20μm厚度的薄片后， 通过显微镜进行实验观察。 但该 方法存在以下缺点： 一方面， 切片过程中组织有损耗； 另一方面， 组织切好处理后， 进行成 像， 相当于对这块组织的局部切面进 行观察， 无法从组织整体进 行观察， 不利于从整体判断 该组织样品中细胞或目标基因的分布、 表达特点； [0005](3)对一定厚度组织成像时， 也可用人为的方法， 将组织按压在带玻璃底的观察皿 中， 但样品组织与玻璃底之 间总是会出现一定空隙， 占据了部 分镜头的工作 距离范围， 导致 可用于样品的深度距离减少。 [0006]综上所述， 如何在保持组织完整性的同时， 高分辨的观察特定细胞在厚组织内部 的分布和数量， 是生物学研究和医学研究亟需解决的问题。 发明内容 [0007]本发明的目的是提供一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方 法， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0008]为解决上述问题， 本发明首先提供了一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片 方法， 包括以下步骤： [0009]S1， 取一块盖玻片放置在第一载物片上， 用胶带覆盖所述的盖玻片和第一载物片； [0010]S2， 挖去盖玻片区域范围内覆盖的胶带， 暴 露大部分盖 玻片， 使用疏水介质处理挖 开区域的边 缘； [0011]S3， 将待观察的组织样品转移至盖玻片上， 吸干样品液体， 滴加抗荧光淬灭剂， 静 置1～3h后， 再次吸干样品溶剂， 滴加凝胶， 使样品固定在盖玻片上； [0012]S4， 取下盖玻片， 放置在第二载物片上， 使所述的组织样品位于盖玻片和第二载物 片之间， 通过胶带将盖玻片四周与第二载物片固定连接， 完成制片。 [0013]优选地， 所述的组织样品的厚度为280～480 μm。 [0014]优选地， 步骤S1中， 根据组织样品的厚度， 覆盖一层至多层胶带， 所述的胶带的总 厚度不超过组织样品的厚度。说　明　书 1/5 页 3 CN 115219308 A 3