(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210916292.8 (22)申请日 2022.08.01 (71)申请人 中央民族大 学 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 27号 (72)发明人 王晓东　王俊丽　刘海强　黄航君　 马伟伟　秦亮　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 王春霞 (51)Int.Cl. G01N 27/64(2006.01) G01N 1/42(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 1/06(2006.01) (54)发明名称 一种植物组织微阵列MALDI-MSI高通量 分析 方法 (57)摘要 本发明公开了一种植物组织微阵列MALDI ‑ MSI高通量分析方法。 所述高通量分析方法包括 如下步骤： 1)将植物组织进行均质得到植物组织 匀浆； 2)将植物组织匀浆填充于模具的若干阵列 排布的通孔中， 冷却成型后进行切片， 得到植物 组织切片； 将植物组织切片融裱在导电玻片上； 3)向植物组织切片上喷涂基质， 进行MALDI ‑MSI 成像分析。 本发 明方法可为植物体内代谢物的生 物合成提供了新的信息， 是植物代谢研究、 指导 组织培养的前期植物生长调节剂使用的有效工 具， 为植物组织培养、 植物代谢研究和植物资源 开发提供参 考。 权利要求书1页 说明书21页 附图7页 CN 115326915 A 2022.11.11 CN 115326915 A 1.一种植物组织 微阵列MALDI ‑MSI高通量分析方法， 包括如下步骤： 1)将植物组织进行均质得到植物组织匀浆； 2)将所述植物组织匀浆填充于模具的若干阵列排布 的通孔中， 冷却成型后进行切片， 得到植物组织切片； 将所述 植物组织切片融裱在导电玻片上； 3)向所述 植物组织切片上喷涂基质， 进行MALDI ‑MSI成像分析。 2.根据权利要求1所述的分析 方法， 其特 征在于： 所述 植物组织 为植物叶片。 3.根据权利要求1或2所述的分析方法， 其特征在于： 将所述植物组织置于设有瓷珠的 均质管中进行均质处 理， 条件如下： 7500～15000rpm转速下均质3 0～60s， 重复2 ～3次， 每次间隔15s。 4.根据权利要求1 ‑3中任一项所述的分析方法， 其特征在于： 所述模具的材质为明胶、 石蜡或琼脂 。 5.根据权利要求 4所述的分析 方法， 其特 征在于： 所述模具按照下述方法制备： 在一盒体 中加入明胶溶液、 石蜡溶液或琼脂溶液， 然后向所述明胶溶液、 石蜡溶液或琼 脂溶液中布置若干阵列排布的细管， 冷却成型； 然后取出成型后的明胶 并移除所述细管即 得到所述模具； 所述细管的外径为1.0～ 2.0mm。 6.根据权利要求5所述的分析方法， 其特征在于： 所述细管由移液枪枪头切除粗端和细 端得到； 所述细管粘贴于所述盒盖上。 7.根据权利要求1 ‑6中任一项所述的分析方法， 其特征在于： 所述植物 组织切片的厚度 为10～30 μm。 8.根据权利要求1 ‑7中任一项所述的分析方法， 其特征在于： 所述基质为2 ‑巯基苯并噻 唑、 2,5‑二羟基苯甲酸或α ‑氰基‑4‑羟基肉桂酸； 采用甲醇、 水与甲酸或三氟乙酸的混合液配制所述基质的溶 液。 9.根据权利要求1 ‑8中任一项所述的分析方法， 其特征在于： 所述基质的溶液的浓度为 12～25mg/mL； 所述喷涂的条件为： 喷涂器与所述 导电玻片的距离为10～3 0cm； 喷涂程序为： 每次喷涂基质3～5s， 孵 育12～20s， 干燥10～ 20s。 10.模具在植物组织的微阵列MALDI ‑MSI高通量分析中的应用； 所述模具由明胶、 石蜡或琼脂制成， 其上设有 若干阵列排布的通 孔； 所述通孔的内径为0.5～1.5m m。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115326915 A 2一种植物组织微阵列MAL DI‑MSI高通量分析方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种植物组织 微阵列MALDI ‑MSI高通量分析方法， 属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]植物组织培养是一种用途广泛的技术， 具有增殖速度快、 不受区域或季节变化影 响、 能产生特定的次生代谢产物和保护传统药用植物等优点。 植物生长调节剂(Plant   growth regulators， PGRs)在培养过程中深刻影响植物的代谢过程， 从而影 响他们的生长、 发育以及形态特征等。 因此， 研究不同PGRs处理的样品中代谢物的变化是植物组织培养研 究中的重要部分， 同时也是最困难和最复杂的部分。 [0003]目前， 对小分子代谢物进行定性定量分析的方法主要有液相色谱 ‑质谱(Liquid   chromatography ‑mass spectrometry,LC ‑MS)、 气相色谱 ‑质谱(Gas chromatography ‑mass  spectrometry,GC ‑MS)、 核磁共振(Nuclear  magnetic  resonance,NMR)和傅立叶变换红外 光谱‑质谱(Fourier  transform  infrared  spectrometry ‑mass spectrometry,FTIR ‑MS) 等。 其中， 色谱 ‑质谱联用技术是目前植物代谢组学研究中应用最广泛的方法， 具有分离效 率好、 灵敏度高、 经济实用等优点。 而LC ‑MS依赖于标品， GC ‑MS通常需要衍生化及主要适用 于易挥发化合物， 样品前处理复杂并且存在易导致样品变性的风险。 不同于质谱法， NMR的 结果不依赖于电离条件的类型或使用仪器的偏好， 因此其偏差也较小。 但是， 由于核磁共振 核的极化 率遵循玻尔兹曼分布规 律， NMR也具有灵敏度低的缺 点。 [0004]尽管以上技术可对化合物进行定性和精确的定量分析， 但这是以花费长时间的分 析为代价的， 通常每个样本超过20分钟。 现在， 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱成像 (Matrix assisted  laser desorption/ionization  time of flight mass spectrometry   imaging,MALDI ‑TOF MSI)技术作为一个成熟的技术， 可以直接在组织切片上同时获得内源 性化合物的相对含量和原位空间分布等信息， 能大大缩短分析时间且已经应用于高通量的 代谢组学研究。 新型基质的开发和仪器的改进都极大地扩展了MA LDI‑MSI分析的能力， 但由 于植物组织结构的局限性， 如角质层、 表皮蜡和细胞壁等影响， 这些 因素均导致植物组织电 离效率低、 无法检测低丰度分子等 问题。 因此， MALDI ‑MSI在植物 中的应用仍远远少于动物 或微生物样品。 [0005]近来， 大部分MALDI ‑MSI研究都集中于改进样品制备， 以提高对组织切片分析物的 检测。 植物组织样品制备方法主要包括： 低温冷冻切片和转印技术。 低温切片的关键点是制 作高质量的组织切片， 同时还要避免污染和代谢物的位移， 因此多数植物材料 的样本都是 在‑20℃左右用低温切片机进行组织切片。 根、 茎和果实组织在仪器的样品分析区域范围 内、 形状规则， 均可成功切片。 尽管在实际研究中已有成功沿叶片表面完成了切片的报道， 但叶片和 花瓣通常都是非常薄且脆弱的非平面组织， 切成薄片的难度仍然很大。 除了冷冻 切片外， 一些研究将注意力转移到转印技术上， 然后在转印出来的印迹上进行MSI实验。 这 是解决代谢产物检测问题的另一种方法。 然而， 该方法主要应用于以多孔聚四氟乙烯 (Polytetrafluoroethylene,PTFE)为印迹表面 的解吸电喷雾电离质谱成像(Desorption  说　明　书 1/21 页 3 CN 115326915 A 3