(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210298863.6 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 中南大学 地址 410083 湖南省长 沙市岳麓区麓山 南 路932号 (72)发明人 周鸣　魏建霞　李梦娜　陈峙朋　 薛长宁　段玉梅　郑乐媚　李桂源　 熊炜　曾朝阳　李小玲　 (74)专利代理 机构 长沙市融智专利事务所(普 通合伙) 43114 专利代理师 袁靖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6841(2018.01) C12N 15/11(2006.01)A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或 治疗制剂中的应用 (57)摘要 本发明公开了环状RNA  circBRD7在制备鼻 咽癌诊断和/或治疗制剂中的应用。 该环状RNA   circBRD7可以用于制备鼻咽癌患者的诊断和治 疗制剂， 特别是制备出原位杂交检测法用于诊断 鼻咽癌患者的试剂盒。 通过研究证实cir cBRD7在 鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系中表达下调， 与鼻咽 癌患者的临床进展负相关。 此外， circBRD7在鼻 咽癌中发挥抑瘤基因功能， 外源过表 达circBRD7 能够弥补鼻咽癌 细胞及组织中cir cBRD7的不足， 从而达到逆转鼻咽癌恶性表型的目的。 因此， 基 于circBRD7的表达检测和外源过表达可用于鼻 咽癌患者的早期分子诊断、 进展评估和临床靶向 治疗， 具有重要的临床价 值和推广应用前 景。 权利要求书1页 说明书18页 序列表4页 附图4页 CN 114875143 A 2022.08.09 CN 114875143 A 1.检测环状RNA  circBRD7的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断制剂中的应用， 该环状 RNAcircBRD7的序列见SEQ  NO:1。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的鼻咽癌辅助诊断的制 剂包括原位杂 交检测试剂。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位 杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针， 优选序列如下： circBRD7探针: 5’ ‑TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGT TCACAAG‑3’。 4.根据权利要求2或3所述的应用， 其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂为原位杂交 检测试剂盒。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 所述的原位杂交检测试剂盒包括： 用于原位杂交检测circBRD7表达的寡核苷酸探针： 优选： circBRD7探针: 5’ ‑TAGTTTGAAGTTATCCTGACTGT TCACAAG‑3’； 用于检测内参基因GAP DH的阳性对照探针， 优选以下任一条： 探针序列1： 5' ‑CAGTAGAG GCAGGGATGATGT TCTGGAGAG‑3' 探针序列2： 5' ‑CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG‑3'。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 除了寡核苷酸探针之外， 试剂盒中还含有： 地高辛寡核苷 酸加尾试剂、 抗地高辛 ‑辣根过氧化物酶复合物检测试剂、 DAB染色试剂； 原位 杂交所需其它常规试剂。 7.circBRD7 过表达试剂在制备 鼻咽癌治疗制剂中的应用。 8.根据权利 要求7所述的应用， 其特征在于， 所述的鼻咽癌治疗制剂包括circBRD7的过 表达载体。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述的鼻咽癌治疗制剂包括用于扩增 circBRD7全长序列的引物， 序列如下： 上游： 5’ ‑CCCATCGATg ataacttcaaactaatgtg‑3’， 下划线部分为ClaI识别位 点； 下游： 5’ ‑TTTCCGCGGctgactgttcacaagccg‑3’， 下划线部分为SacI I识别位点。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述的鼻咽癌治疗制剂除了扩增 circBRD7全长的引物之外， 还含有： 环状RNA空载pcDNA3.1(+)circRNA  Mini plasmid、 Quickcut限制性内切酶ClaI和SacII； T4  DNA连接酶； 转染circBRD7过表达载体所需的试剂 Lipofectami neTM 3000以及构建circBRD7表达载体所需的其它常规试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875143 A 2环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或治疗制剂中的 应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤分子生物 学领域， 具体涉及一种环状 RNA circBRD7的原位杂交探 针、 表达载体以及circBRD7用于鼻咽癌诊断和治疗的制剂。 背景技术 [0002]鼻咽癌是一种起源于鼻咽部上皮细胞的恶性头颈部肿瘤， 有明显的区域聚集性， 恶性程度高， 具有强大 的侵袭转移能力。 虽然近年来临床和实验肿瘤学在鼻咽癌诊断方面 有了很大 的发展， 但鼻咽癌患者的预后并没有明显的提高， 局部复发和远处转移仍是鼻咽 癌晚期患者生存率低的主要原因。 早期鼻咽癌患者对放化疗非常敏感， 有非常好的临床疗 效； 但由于鼻咽癌患者的发病位置隐蔽、 早期症状不典型， 许多鼻咽癌患者初诊就是晚期， 错过了最佳的临床治疗阶段， 因而很容易 发生放化疗抵抗和远处转移。 因此， 鼻咽癌的早期 诊断和个体化治疗在鼻咽癌的临床诊断和治疗中非常关键， 但目前临床上尚无鼻咽癌早期 诊断和进展评价的筛选标志物， 确切需要研发和建立一种用于鼻咽癌早期诊断和进展评价 的诊断方法。 [0003]Circular  RNAs(circRNAs)是一类具有调节能力的新型的非编 码RNA， 既缺少5 ’帽 子也没有3 ’poly(A)尾， 是前体 mRNA通过外显子、 内含子 反向剪接或由外显子内含子二者共 同融合到共价闭合环中产生的， 这个过程不同于线性RNA的生成。 CircRNA最早在1976年于 RNA病毒中首次发现， 随后Hsu  MT等人使用电子显微镜技术在猴的肾细胞质中发现了 circRNA的存在。 随着高通量测序和生物信息学的发展， 近年来已经发现了数千个环状RNA， 其中许多环状RNA以组织特异性和疾病特异性的方式表达。 相较于传统的线性 RNA， 环状RNA 具有稳定性、 保守性和功 能多样性等生物学特征， 能在离体的组织和细胞中相对稳定地保 持其来源组织的表达特征， 且操作相 对简单。 因此， 筛选和验证更多的新型circRNA作为肿 瘤诊断和治疗的生物标志物及其应用， 并能尽早在专利领域得到有效的保护， 能显著提升 我国在该技 术领域的国际竞争力。 [0004]本发明中我们证实了circ_0039345是由BRD7基因的6 ‑8号外显子反向剪切而成， 全长420bp， 证实了circ_0039345真实存在于鼻咽癌细胞中， 因此将其命名为circBRD7。 此 外， 我们设计并合 成了用于扩增circBRD7全长的引物， 构建了circBRD7的过表达载体， 成功 表达出完整的环状RNA  circBRD7， 弥补了鼻咽癌细胞和组织中circBRD7的不足； 并发现 circBRD7的表达与鼻咽癌的发生发展密切相关， 作为抑瘤基因参与了鼻咽癌的发生发展， 因此circBRD7有可能成为鼻咽癌的诊断和治疗的重要分子靶点。 发明内容 [0005]本发明证实了circBRD7是由BRD7基因的6 ‑8号外显子反向剪切而成， 全长420bp， 在鼻咽癌组织中及鼻咽癌细胞系中表达下调， 与鼻咽癌患者的临床进展负相关， 可用于鼻 咽癌患者的辅助诊断和治疗。说　明　书 1/18 页 3 CN 114875143 A 3