(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202280003194.3 (22)申请日 2022.03.09 (66)本国优先权数据 PCT/CN2021/079821 2021.0 3.09 CN PCT/CN2021/1 13929 2021.08.2 2 CN PCT/CN2021/1219 26 2021.09.2 9 CN (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2022.09.16 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CN2022/079890 202 2.03.09 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2022/188797 EN 202 2.09.15 (71)申请人 辉大(上海)生物科技有限公司 地址 200131 上海市浦东 新区自由贸易试 验区巴圣路16 0号7号楼1单 元1002室(72)发明人 王兴　王少冉　姚璇　梅明　 施霖宇　 (74)专利代理 机构 北京市金杜律师事务所 11256 专利代理师 陈文平　徐志明 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 35/00(2006.01) A61K 48/00(2006.01) C12N 15/52(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/86(2006.01) (54)发明名称 工程化CRISPR/Cas13系统及其用途 (57)摘要 本发明提供新型工程化CRISPR/Cas效应酶， 如Cas13(例如， Cas13e)， 与对应的野生型Cas相 比， 所述工程化CRISPR/Cas效应酶基本 上保持指 导序列特异性内切核酸酶活性， 并且基本上缺乏 非指导序列依赖性旁切内切核酸酶活性。 还提供 编码所述工程化CRISPR/Cas效应酶的多核苷酸、 包含所述多核苷酸或工程化Cas的载体或宿主细 胞、 以及例如在基于RNA的靶基因转录物敲低中 的使用方法。 权利要求书9页 说明书62页 序列表57页 附图5页 CN 115427561 A 2022.12.02 CN 115427561 A 1.一种重组腺相关病毒(r AAV)载体基因组， 所述r AAV载体基因组包含： (1)编码Cas13X多肽的Cas13X多核苷酸， 所述Cas13X多核苷酸与SEQ  ID NO:1具有至少 80％、 85％、 90 ％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.2％、 99.4％、 99.6 ％、 99.8％、 或99.9％ 同一性， 所述Cas13 X多肽包含在SEQ  ID NO:4的Y672、 Y676、 和/或I751处的1 ‑3个取代， 并且 具有与SEQ  ID NO:4基本上相同(例如， 至少约80％、 90％、 95％、 99％或更多)的指导RNA特 异性核酸酶活性并且基本上没有(例如， 最多20％、 15％、 10％、 5％)SEQ  ID NO:4的旁切(非 指导RNA依赖性)核酸酶活性； 以及 (2)在所述Cas13X多 核苷酸的3'的po lyA信号序列； 任选地， 所述Cas13X多肽具有SEQ  ID NO:2或3的氨基酸序列。 2.如权利要求1所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组包含5 ’AAV ITR序列和3 ’ AAV ITR序列。 3.如权利要求1或2所述的rAAV载体基因组， 其中所述5'AAV  ITR序列和所述3'AAV  ITR 序列都是来自以下的野生型AAV  ITR序列： AAV1、 AAV2、 AAV3A、 AAV3B、 AAV4、 AAV5、 AAV6、 AAV7、 AAVr h74、 AAV8、 AAV9、 AAV10、 AAV11、 AAV12、 AAV13、 或所述AAV1 ‑AAV13中的任 一者所属 的进化枝的成员， 或其功能性截短变 体。 4.如权利要求1 ‑3中任一项所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组进一步包含 与所述Cas13X多 核苷酸可操作地连接并驱动其 转录的启动子 。 5.如权利要求 4所述的r AAV载体基因组， 其中所述启动子是泛素启动子 。 6.如权利要求 4所述的r AAV载体基因组， 其中所述启动子是组织特异性启动子 。 7.如权利要求 4‑6中任一项所述的r AAV载体基因组， 其中所述启动子是组成型启动子 。 8.如权利要求 4‑6中任一项所述的多 核苷酸， 其中所述启动子是诱 导型启动子 。 9.如权利要求4 ‑8中任一项所述的rAAV载体基因组， 其中所述启动子选自pol  I启动 子、 pol II启动子、 pol  III启动子、 T7启动子、 U6启动子、 H1启动子、 逆转录病毒劳斯肉瘤病 毒LTR启动子、 巨细胞病毒(CMV)启动子、 SV40启动子、 二氢叶酸还原酶启动子、 β ‑肌动蛋白 启动子、 延伸因子1α 短(EFS)启动子、 β 葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、 巨细胞病毒(CMV)即早 (Ie)增强子和/或启动子、 鸡β ‑肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、 CB启动子、 (人)延伸因子1α ‑亚基(EF1α )启动子、 泛素C(UBC)启动子、 朊病毒启动子、 神经元特异性烯 醇化酶(NSE)、 神经丝轻链(NFL)启动子、 神经丝重链(NFH)启动子、 血小板衍生生长因子 (PDGF)启动子、 血小板衍生生长因子B 链(PDGF‑β )启动子、 突触蛋白(Syn)启动子、 突触蛋白 1(Syn1)启动子、 甲基 ‑CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II (CaMKII)启动子、 代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、 神经丝轻链(NFL)启动子、 神经丝重 链(NFH)启动子、 β ‑珠蛋白小基因nβ2启动子、 前脑啡肽原(PPE)启动子、 脑啡肽(Enk)启动 子、 兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、 髓鞘碱性蛋 白(MBP)启动子 。 10.如权利要求9所述的rAAV载体基因组， 其中所述启动子是所述延伸因子1α短(EFS) 启动子， 如SEQ  ID NO:12。 11.如权利要求1 ‑10中任一项所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组进一步包 含与所述Cas13X多肽的N ‑末端、 C‑末端、 或内部融合的核定位序列(NLS)的编码序列， 和/或 与所述Cas13X多肽的N ‑末端、 C‑末端、 或内部融合的核输出信号(NES)的编码序列。权　利　要　求　书 1/9 页 2 CN 115427561 A 212.如权利要求11所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组包含在所述Cas13X多 核苷酸的5'的第一NLS编码序列、 和/或在所述Cas13X多核苷酸的3'的第二NLS编码序列(例 如， 包含所述第一 NLS编码序列和所述第二 NLS编码序列两者)。 13.如权利 要求11或12所述的rAAV载体基因组， 其中所述NLS、 所述第一NLS和所述第二 NLS独立地选自SEQ  ID NO:20‑48。 14.如权利要求1 ‑13中任一项所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组进一步包 含Kozak序列或其功能性变 体(如SEQ ID NO:13)。 15.如权利要求1 ‑14中任一项所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组进一步包 含聚腺苷酸 化(polyA)信号序列。 16.如权利 要求15所述的rAAV载体基因组， 其中所述polyA信号序列选自生长激素 聚腺 苷酸化信号(bGH  polyA)、 小polyA信号(SPA)、 人生长激素聚腺苷酸化信号(hGH  polyA)、 SV40 polyA信号(SV40  polyA)、 兔β 珠蛋白po lyA信号(rBG  polyA)、 或其变 体。 17.如权利要求16所述的rAAV载体基因组， 其中所述polyA信号序列是SV40polyA信号 序列或其功能性变 体(如SEQ ID NO:15)。 18.如权利要求1 ‑17中任一项所述的rAAV载体基因组， 所述rAAV载体基因组进一步包 含第二转录单元， 所述第二转录单元包含RNA  pol III启动子， 其中所述第二转录单元在所 述Cas13X多 核苷酸的3'。 19.如权利要求18所述的rAAV载体基因组， 其中所述RNA  pol III启动子是U6(如SEQ   ID NO:16)、 H1、 7SK、 或其变 体。 20.如权利要求1 ‑18中任一项所述的rAAV载体基因组， 其中所述第二转录单元进一步 包含第二编码序列， 所述第二编码序列与所述RNA  pol III启动子可操作地连接、 编码一个 或多个单个指导RNA(sgRNA)， 每个sgRNA与靶RNA序列互补， 并且各自能够引导所述Cas13X 多肽切割所述靶RNA； 任选地， 每个所述sgRNA包含与所述Cas13X多肽结合的同向重复(DR) 序列。 21.如权利要求20所述的rAAV载体基因组， 其中所述DR序列是与SEQ  ID NO:6具有至少 90％同一性， 与SEQ  ID NO:6相差最多1、 2、 3、 4或5个核苷酸， 和/或与SEQ  ID NO:6具有基本 上相同的二级结构的核酸序列。 22.如权利要求21所述的rAAV载体基因组， 其中所述DR序列包