(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210301504.1 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 陕西科技大 学 地址 710021 陕西省西安市未央区大 学园 (72)发明人 李国梁　潘瑞媛　刘江花　王盼雪　 苏卓群　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 张宇鸽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介 导的拉曼传感器及其检测羊乳掺假的方法和应 用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测羊乳掺假的 CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器及其检测羊乳 掺假的方法和应用， 属于分析化学和食品安全领 域。 该拉曼传感器包括单链DNA ‑普鲁士蓝纳米颗 粒探针、 由CRISPR/Cas12a蛋白、 crRNA、 缓冲液以 及提取扩增后的羊乳样品DNA构成的Cas12a酶切 反应体系、 含 氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基 底的金核银壳纳米颗粒溶液。 将该拉曼传感器应 用于羊乳中掺假成分为牛乳的检测中， 目标DNA 含量可以经拉曼光谱仪检测转化为超灵敏、 抗干 扰的拉曼信号。 该拉曼传感器及其方法对目标 DNA的检出限可达到aM级别， 目标DNA的设计选 取 灵活， 以牛线粒体cytb基因为目标DNA， 能够应用 于羊乳中的掺假成分为牛乳的检测中， 具有快 速、 灵敏、 准确以及背景干 扰低等优点。 权利要求书2页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 114621999 A 2022.06.14 CN 114621999 A 1.一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器， 其特征在于， 包括单链 DNA‑普鲁士蓝纳米颗粒探针、 Cas12 a酶切反应体系、 含氢氧根的溶液以及作为拉曼增强基 底的金核银壳纳米颗粒 溶液； 其中， 所述单链DNA ‑普鲁士蓝纳米颗粒探针中， 单链DNA的5 ’端修饰生物素， 3 ’端修饰 氨基， 单链DNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示； 所述Cas12a酶切反应体系由CRISPR/ Cas12a蛋白、 crRNA、 缓冲液以及提取扩增后的羊乳样品DNA构成， 其中， crRNA的识别 序列与 牛线粒体基因cytb上的片段互补， 牛线粒体基因cytb上的片段的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.9所示。 2.如权利 要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器， 其 特征在于， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示。 3.如权利 要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器， 其 特征在于， 所述扩增为环介导等 温扩增， 环介导等 温扩增所用引物包括牛 ‑FIP引物、 牛 ‑BIP 引物、 牛‑F3引物和牛 ‑B3引物； 其中， 所述牛 ‑FIP引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示， 牛 ‑BIP引物的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.5所示， 牛 ‑F3引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示， 牛 ‑B3引物的核苷酸序列 如SEQ.ID.NO.3所示。 4.如权利 要求3所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器， 其 特征在于， 所用引物还 包括牛‑LF引物和牛 ‑LB引物； 其中， 所述牛 ‑LF引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示， 牛 ‑LB引物的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.7 所示。 5.如权利 要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器， 其 特征在于， 缓冲液为10 ×NEBuffer 2.1。 6.权利要求1所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检测 羊乳掺假的方法， 其特 征在于， 按照以下步骤进行： 1)以普鲁士蓝纳米颗粒和单链DNA为原料制备单链DNA ‑普鲁士蓝纳米颗粒探针并固 定； 2)将Cas12a酶切反应体系加入至步骤1)中进行剪切反应， 弃上清液， 洗涤， 加NaOH溶液 处理， 制得碱处 理溶液； 3)将步骤2)制得的碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液混合， 搅拌， 滴在玻片上， 拉曼 光谱仪扫描， 以空白组和实验组在拉曼位移为2083cm‑1处的峰值差 为信号建立 标准曲线， 根 据标准曲线测定含未知浓度牛乳的羊乳样品中目标DNA含量。 7.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检 测羊乳掺假的方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所述剪切反应的条件为在37℃条件下孵育30～ 80分钟。 8.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检 测羊乳掺假的方法， 其特征在于， 步骤3)中， 所述碱处理溶液与金核银壳纳米颗粒溶液的体 积比为1： 10 。 9.如权利要求5所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼传感器检 测羊乳掺假的方法， 其特征在于， 步骤3)中， 拉曼光谱仪扫描条件为： 激光波长785nm， 激光权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114621999 A 2能量10mW， 扫描时间为20秒， 积分次数1次。 10.权利要求1‑5任意一项所述的一种用于检测羊乳掺假的CRISPR/Cas12a介导的拉曼 传感器在检测羊乳的掺 假成分为牛乳中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114621999 A 3