(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210543136.1 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 刘吉平　黄裕鑫　罗龙辉　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑 疫病的检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种扁桃假单胞菌、 丁香假单 胞菌和/或桑疫病的检测试剂盒。 本发明根据核 苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的编码桑疫病病原 菌扁桃假单胞菌和/或丁香假单胞菌的假定蛋白 的基因， 设计检测桑疫病病原菌扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病的引物组， 用于PCR和 LAMP检测， 用于PCR检测的引物组的核苷酸序列 如SEQ ID NO： 8～9所示， 用于LA MP检测的引物组 的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 32～35所示， 具有高 特异性和灵敏性， 反应结果可以肉眼识别。 含有 上述引物组的PCR和LAMP检测试剂盒， 用于桑园 桑树和桑苗流通中的传染性桑疫病病原菌扁桃 假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病的快速检 测。 权利要求书1页 说明书13页 序列表7页 附图6页 CN 114774562 A 2022.07.22 CN 114774562 A 1.一种基因和/或检测试剂在检测扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病中的应 用， 其特征在于， 所述基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述检测试剂用于检测核苷 酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的序列或其片段。 2.一种检测扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病的试剂， 其特征在于， 所述试剂 用于检测权利要求1中所述核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的序列或其片段。 3.根据权利要求2所述的试剂， 其特征在于， 所述试剂含有核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8 ～9所示的引物组或核苷酸序列如SEQ  ID NO： 32～35所示的引物组。 4.权利要求2或3所述的试剂在制备扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病的检测 试剂盒， 或检测扁桃假单 胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病中的应用。 5.一种扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检 测试剂盒含有权利要求2所述的检测试剂。 6.根据权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒为PCR检测试剂盒， 所述检测试剂盒含有 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8～9所示的引物组。 7.根据权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒为LAMP检测试剂 盒， 所述检测试剂盒含有 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 32～35所示的引物组。 8.一种非治疗和/或诊断目的检测扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病的方法， 其特征在于， 针对权利要求1中所述核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的基因设计引物组， 检 测扁桃假单 胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑疫病。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述引物组含有核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8～9所示的引物组， 进行PCR扩增反应。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述引物组含有核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 32～35所示的引物组， 进行LAMP扩增反应。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774562 A 2一种扁桃假单胞菌、 丁香假单胞菌和/或桑 疫病的检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及植物病菌分子检测技术领域， 具体地， 涉及一种扁桃假单胞菌、 丁香假 单胞菌和/或桑疫病的检测试剂盒。 背景技术 [0002]蚕桑产业的发展深受桑细菌、 真菌和病毒病害的困扰， 桑疫病与桑青枯病、 桑枯萎 病共称为桑树三大传染性细菌性病害， 严重影响蚕桑产业的健康发展。 桑疫病病原菌的早 期鉴定是防控 桑枯萎病的重要手段。 桑疫病病害 特征较为 典型， 俗称 “烂头病”， 其为全株性 病害， 病株顶叶 叶片卷曲， 叶脉处腐烂， 脱落， 顶部 芽叶变黑腐朽， 形成烂 头现象。 [0003]中国江苏、 浙江、 安徽、 湖北、 湖南、 四川 、 陕西、 云南、 江西、 广西等全国大部分蚕区 的桑园均有发生， 特别是种 植“桐乡青”、“黄鲁头”、“湖桑7号”以及“强桑”系列的易感桑树 品种， 发病率可高达70％～8 0％， 给蚕桑生产造成了严重的经济损失(戴荷芳,周水良,堵鹤 鸣等.关于桑树细菌性黑枯病——缩叶型病的研究[J].蚕业科学,1980(03):150 ‑154.； 包 奇,曹梦琪,周雨等.基于实时荧光定量PCR技术检测桑丁香假单胞菌[J].蚕业科学,2016, 42(02):210 ‑218.)。 在夏秋季节， 雨水较多时， 特别是在高温多湿和 有风的环境下， 病 菌很 容易大量繁殖传播， 从而导致病害 大面积传播 感染， 危害程度加重。 桑疫病病原菌在能在土 壤和水体中存活数月， 也可随病残枝存活到次年夏秋季， 在发病过的桑园中应对土壤、 水体 等环境进行全面消杀工作， 及时妥当处 理病枝， 防止来 年疾病重新爆发。 [0004]桑疫病作为一种由丁香假单胞菌桑致病变种(Pseudomonas  syringae  pv.Mo ri， 与扁桃假单胞菌桑致病变种Pseudomonas  amygdali  pv.mori是异形的同义词)侵染导致的 桑树细菌性病害之一， 具有强致病性和传染性(蒯元璋.桑树病原原核生物及其病害的研究 进展(Ⅰ)[J].蚕业科学,2012,38(01): 152‑164.)。 最近研究认为桑来源的丁香假单胞菌应 该为桑扁桃假单胞菌(Pseudomonas  amygdal i)(Yamamoto  S,Kasai H,Arnold  D L,et  al.Phylogeny  of the genus Pseudomona  s:Intrageneric  structure  reconstructed   from the nucleotide  sequences  of gyrB and rpoD gen es[J].Microbiology (Reading),2000,146(10):2385 ‑2394； Baltrus,D.A.,Nishimura,M.T.,Romanchuk,A.,et   al.,.Dynamic  evolution  of pathogenicity  revealed  by sequencing  and co  mparative genomics  of 19Pseudomonas  syringae  isolates.PLoS  pathogens,2011,7 (7),e1002  132.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002132)。 桑疫病病 原菌感染 桑芽叶引起的病害， 以危害枝 条顶端叶片及 嫩梢为主， 严重的易导致桑树出现坏死、 枯死的 现象。 桑疫病的症状主要有黑枯型和缩叶型两类， 病株在桑树顶端表现叶缩黑枯症状， 在枝 条上形成粗细不等的棕褐色线状病斑， 严重影响桑叶的产量和质量。 桑疫病菌病原菌随病 枝在不同处理下(灭菌土内、 自然土表、 自然土内10cm)可存活至次年5月份。 病原菌在灭菌 土内和自然土表可存活到次年6月份。 [0005]目前有尚未有彻底根治桑疫病的方法， 因此生产上急需一种可进行桑疫病病原菌 早期检测的方法， 亟需建立一种 可对桑疫病的病原菌进行检测和 鉴定的方法， 以便于做好说　明　书 1/13 页 3 CN 114774562 A 3