(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210681597.5 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 尧唐(上海)生物科技有限公司 地址 201100 上海市闵行区潭竹路58号1幢 1201室 (72)发明人 张红玲　任文丹　 (74)专利代理 机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 1 1240 专利代理师 路秀丽 (51)Int.Cl. C12N 9/22(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 15/85(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A61K 38/46(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 7/06(2006.01) A61P 13/12(2006.01) A61P 21/00(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 43/00(2006.01) (54)发明名称 CRISPR-Cas效应子蛋白、 其基因编辑系统及 应用 (57)摘要 本发明提供了一种CRISPR ‑Cas效应子蛋白、 其基因编辑系统及应用。 其中， CRISPR ‑Cas效应 子蛋白包括与SEQ  ID NO： 1至5中任一项所述的 氨基酸序列具有至少70％同一性的蛋白。 能够解 决现有技术中的CRISPR/Cas系统切割效率低的 问题， 适用于 基因编辑领域。 权利要求书7页 说明书30页 序列表60页 附图7页 CN 114921439 A 2022.08.19 CN 114921439 A 1.一种CRISPR ‑Cas效应子蛋白， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas效应子蛋白包括与SEQ   ID NO： 1至5中任一项所述的氨基酸序列具有至少70％同一 性的蛋白。 2.根据权利要求1所述的CRISPR ‑Cas效应子蛋白， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas效应子 蛋白包括与SEQ  ID NO： 1至5中任一项所述的氨基酸序列具有80％以上， 优选90％以上， 更 优选95％以上， 进一 步优选99％以上同一 性的蛋白； 优选地， 所述CRIS PR‑Cas效应子蛋白包括RuvC结构域。 3.根据权利要求2所述的CRISPR ‑Cas效应子蛋白， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas效应子 蛋白包括： a)SEQ ID NO： 1至5中任一项所示的蛋白； 或 b)以SEQ ID NO： 1所示的氨基酸序列为基础， 进行如下一种或多种点 突变的蛋白： N21X， N23X， R25X， K26X， Q482X， S484X， R486X， S489X， R493X， H511X， C513X， H515X， N516X， R518X， R540X， K558X， Y560X， K562X， K565X， T600X， T672X， D676X， Q680X， Y683X， L686X， D693X， Y731X， G767 X， R772X， K832X， K83 3X， Q836X， M896X； 或 c)以SEQ ID NO： 2所示的氨基酸序列为基础， 进行如下一种或多种点 突变的蛋白： R19X， R28X， R32X， K512X， N527X， W531X， R553X， K581X， K589X， I590X， R605X， K611X， R612X， R615X， Y7 77X， E877X， R931X； 或 d)以SEQ ID NO： 3所示的氨基酸序列为基础， 进行如下一种或多种点 突变的蛋白： K8X， F15X， N17X， K20X， K471X， W483X， H502X， R505X， K557X， K556X， R560X， Y673X， L676X， Y723X， N82 2X， K823X， E826X， K827 X， K830X， K880X， L887X； 或 e)以SEQ ID NO： 4所示的氨基酸序列为基础， 进行如下一种或多种点 突变的蛋白： K317X， W330X， Y351X， K354X， D392X， F395X， N399X， Y509X， V512X， Y568X， N662X， K663X， E666X， R667X， K670X， K 719X， L726X； 或 f)以SEQ ID NO： 5所示的氨基酸序列为基础， 进行如下一种或多种点 突变的蛋白： M9X， V16X， D18X， K21X， K518X， W531X， F550X， K553X， R609X， Y612X， R616X， Y730X， L733X， Y781X， N879X， K8 80X， E883X， K884X， K887X， K936X， F943X； 其中X为任意氨基酸。 4.一种CRISPR ‑Cas效应子融合蛋白， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas效应子融合蛋白包 括权利要求1至3中任一项所述的CRISPR ‑Cas效应子蛋白、 或所述CRISPR ‑Cas效应子蛋白的 衍生物或所述CRIS PR‑Cas效应子蛋白的功能片段， 以及异源功能结构域。 5.根据权利要求4所述的CRISPR ‑Cas效应子融合蛋白， 其特征在于， 所述异源功能结构 域位于所述CRIS PR‑Cas效应子融合蛋白的N端、 C端或内部； 优选地， 所述异源功能结构域包括定位信号、 报告蛋白、 CRISPR ‑Cas效应子蛋白靶向部 分、 DNA结合域、 表 位标签、 转录激活域、 转录抑制域、 核酸 酶、 脱氨结构域、 甲基化 酶、 脱甲基 酶、 转录释放因子、 HDAC、 裂解活性多肽、 连接酶中的一种或多种； 优选地， 所述定位信号包括核定位信号和/或核输出信号； 优选地， 所述核输出信号包括人类蛋白酪氨酸激酶2； 优选地， 所述报告蛋白包括谷胱甘肽 ‑S‑转移酶、 辣根过氧化物酶、 氯霉素乙酰转移酶、 β‑半乳糖苷酶、 β ‑葡糖醛酸糖苷酶 或自发荧 光蛋白中的一种或多种； 优选地， 所述自发荧光 蛋白包括绿色荧光蛋白、 HcRed、 DsRed、 青荧光蛋白、 黄色荧光蛋权　利　要　求　书 1/7 页 2 CN 114921439 A 2白或蓝色荧 光蛋白中的一种或多种； 优选地， 所述DNA结合 域包括甲基化结合蛋白、 Lex  A DBD或Gal 4 DBD中的一种或多种； 优选地， 所述表位标签包括组氨酸标签、 V5标签、 FLAG标签、 流感病毒血凝素标签、 Myc 标签、 VSV ‑G标签或硫氧还蛋白标签中的一种或多种； 优选地， 所述 转录激活域包括VP64和/或VPR； 优选地， 所述 转录抑制域包括KRAB和/或SID； 优选地， 所述核酸酶包括Fo kI； 优选地， 所述脱氨结构域包括ADAR 1、 ADAR2、 APOBE C、 AID或TAD中的一种或多种； 优选地， 所述裂解活性多肽包括具有单链RNA裂解活性的多肽、 具有双链RNA裂解活性 的多肽、 具有单链DNA裂解活性的多肽或具有双链DNA裂解活性的多肽； 优选地， 所述连接酶包括DNA连接酶和/或RNA连接酶。 6.一种DNA分子， 其特征在于， 所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的CRISPR ‑ Cas效应子蛋白、 或权利要求 4或5所述的CRIS PR‑Cas效应子融合蛋白。 7.根据权利 要求6所述的DNA分子， 其特征在于， 所述DNA分子为根据宿主细胞的密码子 偏好性进行密码子优化的DNA分子； 优选地， 宿主细胞包括原核细胞或真核细胞； 优选地， 所述DNA分子包括与SEQ  ID NO： 6至10中任一项所述的核苷酸序列具有70％以 上， 优选90％以上， 更优选95％以上， 进一步优选99％， 更进一步优选为100％同一性的核苷 酸。 8.一种重组载体， 其特 征在于， 所述重组载体包 含权利要求6或7 所述的DNA分子 。 9.根据权利要求8所述的重组载体， 其特 征在于， 所述DNA分子与启动子连接； 优选地， 所述启动子包括诱导型启动子、 组成型启动子或组织特异性启动子中的一种 或多种； 优选地， 所述启动子包括T7、 SP6、 T3、 CMV、 EF1a、 SV40、 PGK1、 hu manβ‑actin、 CAG、 U6、 H 1、 T7、 T7lac、 araBAD、 t rp、 lac或Ptac中的一种或多种； 优选地， 所述重组载体包括逆转录病毒载体、 慢病毒载体、 腺病毒载体、 腺相关病毒载 体、 单纯疱疹载体或噬菌粒 载体； 优选地， 所述重组载体包括质粒 载体。 10.一种宿主细胞， 其特 征在于， 所述宿主细胞转 化有权利要求8或9所述的重组载体。 11.一种基因编辑系统， 其特 征在于， 所述基因编辑系统包括： a)RNA指导物或编码所述RNA指导物的核酸， 所述RNA指导物包括直接重复序列和间隔 子序列， 所述间隔子序列用于与靶核酸杂交； b)权利要求1至3中任一项所述 的CRIS