(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210677254.1 (22)申请日 2022.06.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114774365 A (43)申请公布日 2022.07.22 (73)专利权人 呈诺再生医学 科技 （北京） 有限公 司 地址 100176 北京市大兴区经济技 术开发 区科创十三 街18号院13号楼3层3 02 (72)发明人 龚士欣　顾雨春　李楠　蒋明月　 曹文华　彭钦清　吴理达　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍(51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/0789(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 7/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 112831462 A,2021.0 5.25 WO 2021118226 A1,2021.0 6.17 CN 108473961 A,2018.08.31 WO 2017078 807 A1,2017.0 5.11 CN 106032527 A,2016.10.19 审查员 梁波 (54)发明名称 一种诱导iPSC分化获得CD34+细胞和NK细胞 的方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种诱导iPSC分化获得CD34+ 细胞和NK细胞的方法及其应用， 所述方法利用拟 胚体的三维结构为iPSC分化提供良好的分化微 环境， 在缺氧诱导培养条件下第4天即可开始产 生高比例的CD34+细胞， 随后通过拟胚体贴壁或 者消化再悬浮诱导 分化的方式， 显著提高了iPSC 诱导NK细胞分化的产量， 且 诱导分化得到的NK细 胞在短时间内即可发挥对肿瘤细胞的杀伤作用， 具有较强的肿瘤杀伤能力， 适合规模化细胞制剂 的生产和临床应用。 权利要求书3页 说明书15页 附图11页 CN 114774365 B 2022.08.23 CN 114774365 B 1.一种诱导iPSC分化制备获得CD34+细胞的培养基， 其特征在于， 所述培养基包括第一 阶段培养基、 第二阶段培 养基、 第三阶段培 养基和第四阶段培 养基； 所述第一阶段培 养基为含有ROCK通路抑制剂和聚乙烯醇的E8完全培 养基； 所述第二阶段培 养基为含有GSK ‑3β 抑制剂的E8完全培 养基； 所述第三阶段培 养基包括S PM1培养基和SPM2培养基； 所述第四阶段培 养基为SPM3培养基； 所述SPM1培养基包括stempro ‑34完全培养基、 DMEM/F12培养基、 L ‑谷氨酰胺、 抗坏血 酸、 ITS‑X、 BMP4、 VEGF、 bFGF； 所述SPM2培养基包括所述S PM1培养基和TGF ‑β I型受体ALK5， ALK4和ALK 7的抑制剂； 所述SPM3培养基包括stempro ‑34完全培养基、 DMEM/F12培养基、 L ‑谷氨酰胺、 抗坏血 酸、 ITS‑X、 bFGF、 VEGF、 SCF、 TPO、 FLT ‑3L。 2.根据权利要求1所述的培养基， 其特征在于， 所述第一阶段培养基 中的ROCK通路抑制 剂为Y‑27632； 所述第二阶段培 养基中的GSK ‑3β 抑制剂为C HIR‑99021； 所述第三阶段培 养基中的TGF ‑β I型受体ALK5， ALK4和ALK 7的抑制剂为SB431542； 所述第一阶段培 养基中Y‑27632的浓度为0.5 ‑20 μM； 所述第一阶段培 养基中聚乙烯醇的浓度为2 ‑6 mg/mL； 所述第二阶段培 养基中CHIR‑99021的浓度为1 ‑20 μM； 所述第三阶段培养基中L ‑谷氨酰胺、 抗坏 血酸、 ITS ‑X、 BMP4、 VEGF、 bFGF、 SB431542的浓 度分别为 （0.1 ‑5） %、 （10‑100） μg/mL、 （0.1 ‑5）×、 （10‑100） ng/mL、 （10 ‑100） ng/mL、 （10 ‑100） ng/mL、 （1 ‑10） μM； 所述第四阶段培养基中L ‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 ITS ‑X、 bFGF、 VEGF、 SCF、 TPO、 FLT ‑3L的 浓度分别为 （0.1 ‑5） %、 （10‑100） μg/mL、 （0.1 ‑5）×、 （10‑100） ng/mL、 （10 ‑100） ng/mL、 （10 ‑ 100） ng/mL、 （10 ‑100） ng/mL、 （1 ‑50） ng/mL。 3.根据权利要求2所述的培养基， 其特征在于， 所述第一阶段培养基中Y ‑27632的浓度 为10 μM； 所述第一阶段培 养基中聚乙烯醇的浓度为 4 mg/mL； 所述第二阶段培 养基中CHIR‑99021的浓度为10  μM； 所述第三阶段培养基中L ‑谷氨酰胺、 抗坏 血酸、 ITS ‑X、 BMP4、 VEGF、 bFGF、 SB431542的浓 度分别为1%、 5 0 μg/mL、 1 ×、 50 ng/mL、 50 ng/mL、 50 ng/mL、 6 μM； 所述第四阶段培养基中L ‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 ITS ‑X、 bFGF、 VEGF、 SCF、 TPO、 FLT ‑3L的 浓度分别为1%、 5 0 μg/mL、 1 ×、 50 ng/mL、 50 ng/mL、 50 ng/mL、 30 ng/mL、 10 ng/mL。 4.一种诱导iPSC分化制备获得NK细胞的培养基， 其特征在于， 所述培养基包括第一阶 段培养基、 第二阶段培 养基、 第三阶段培 养基、 第四阶段培 养基、 第五阶段培 养基； 所述第一阶段培养基、 第 二阶段培养基、 第三阶段培养基、 第四阶段培养基为权利要求 1‑3中任一项所述的第一阶段培 养基、 第二阶段培 养基、 第三阶段培 养基、 第四阶段培 养基； 所述第五阶段培 养基为SPM‑NK培养基； 所述SPM‑NK培养基包括stempro ‑34完全培养基、 DMEM/F12培养基、 L ‑谷氨酰胺、 抗坏 血 酸、 ITS‑X、 SCF、 Flt ‑3L、 IL‑3、 IL‑7、 IL‑15；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114774365 B 2所述SPM‑NK培养基中L ‑谷氨酰胺、 抗坏血酸、 ITS ‑X、 SCF、 Flt ‑3L、 IL‑3、 IL‑7、 IL‑15的 浓度分别为 （0.1 ‑5） %、 （10‑100） μg/mL、 （0.1 ‑5）×、 （10‑50） ng/mL、 （1 ‑20） ng/mL、 （1 ‑10） ng/ mL、 （10‑50） ng/mL、 （1 ‑100） ng/mL。 5.根据权利要求4所述的培养基， 其特征在于， 所述SPM ‑NK培养基中L ‑谷氨酰胺、 抗坏 血酸、 ITS ‑X、 SCF、 Flt ‑3L、 IL‑3、 IL‑7、 IL‑15的浓度分别为1%、 50  μg/mL、 1 ×、 20 ng/mL、 10  ng/mL、 5 ng/mL、 20 ng/mL、 50 ng/mL。 6.一种诱 导iPSC分化成CD34+细胞的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (1) 第一阶段， Day   ‑1， 在常氧条件下， 采用权利要求1 ‑3中任一项所述的第一阶段培 养基对iP SC进行悬浮培养， 形成拟胚 体； (2) 第二阶段， Day  0， 在缺氧条件下， 采用权利 要求1‑3中任一项所述的第二阶段培养 基对所述拟胚 体进行诱 导培养， 形成中胚层 细胞； (3) 第三阶段， Day  1‑ Day 4， 在缺氧条件下， 采用权利要求1 ‑3中任一项所述 的第三 阶段培养基对所述中胚层 细胞进行诱 导培养， 形成CD34+生血内皮细胞； (4) 第四阶段， Day  5‑ Day 12， 在常氧条件下， 采用权利要求1 ‑3中任一项所述的第四 阶段培养基对所述CD34+生血内皮细胞进行诱 导培养， 形成CD34+/ CD45+细胞。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述形成拟胚体包括如下步骤： Day  ‑1， 将iPSC消化至单细胞状态， 接种细胞， 加入第一阶段培养基进行重悬培养， 形成拟 胚体； 所述接种细胞密度为1 ×105‑2×105/mL； 步骤(3)中所述形成CD34+生血内皮细胞包括如下步骤： (a) Day 1， 将所述中胚层 细胞在SPM1培养基中进行诱 导培养； (b) Day 2， 将所述S PM1培养基更换为SPM2培养基进行诱 导培养； (c) Day 3， 半换液， 弃去一半旧的S PM2培养基， 加入一半新的S PM2培养基； (d) Day 4， 拟胚体贴壁培 养， 形成CD34+生血内皮细胞。 8.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 步骤(1)中所述接种细胞密度为1 ×105/mL； 步骤(1)中所述培 养的条件为5%  CO2， 37℃恒温培 养； 步骤(2)中所述培 养的条件为5%  CO2， 90% N2， 37℃恒温培 养； 步骤(3)中所述培 养的条件为5%  CO2， 90% N2， 37℃恒温培 养； 步骤(4)中所述培 养的