(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210684830.5 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 重庆医科 大学 地址 400000 重庆市渝中区石油路102号 55-18-4 (72)发明人 倪忆庐　 (74)专利代理 机构 北京博识智 信专利代理事务 所(普通合伙) 16067 专利代理师 魏文密 (51)Int.Cl. A61K 35/33(2015.01) A61K 35/15(2015.01) A61K 9/06(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01) C12N 5/09(2010.01) C12N 5/077(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) (54)发明名称 治疗三阴性乳腺癌 的脱细胞基质复合水凝 胶及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种治疗三阴性乳腺癌 的脱细 胞基质复合水凝胶及其制备方法， 具体包括以下 步骤： 一)脱细胞基质的制备： 1)同种异 体化细胞 的提取： 1A)基质细胞的提取(以肿瘤相关成 纤维 细胞为例)； 1B)免疫细胞的提取(以巨噬细胞为 例)； 2)脱细胞基质的提取； 二)脱细胞基质复合 水凝胶的制备。 本发明优点在于： 制作方法简单， 天然无毒， 使用简便， 安全有效， 有效缓解瘤内免 疫抑制水平， 防止肿瘤复发及转移， 具有很好的 推广前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114939129 A 2022.08.26 CN 114939129 A 1.治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶的制备方法， 其特征在于具体包括以下 步骤： 一)脱细胞基质的制备： 1)同种异体化细胞的提取： 1A)基质细胞的提取(以肿瘤相关成纤维细胞为例)： 将Balb/c小鼠肿瘤组织及癌旁组 织放入培养皿， 用含20％双抗(青霉素与链霉素)的PBS洗涤3次， 用剪刀将组织破碎并置于 50mL离心管中， 用5 ‑10mL胶原酶在37℃下孵育消化1h， 经100 μm孔径的滤网过滤， 滤后的细 胞悬液转入50mL离心管中， 于200g转速下离心3min， 摒弃上清液后加 入10mL PBS小心吹打 细胞， 继续离心3min， 吸去 上清液后用含10％FBS的培养基吹散细胞并分装至培养皿中进 行 体外培养， 细胞开始贴壁生长后， 用PBS小心清洗培养皿， 肿瘤相关成纤维细胞可贴壁生长， 其它细胞随PBS滑落， 获得贴壁的肿瘤相关成纤维细胞并体外 培养扩增； 1B)免疫细 胞的提取(以巨噬细 胞为例)： 取Balb/c小鼠的股骨与胫骨， 去除皮肤与肌肉 组织后， 用含20％双抗的PBS洗涤3次， 用剪刀去除关节头， 用1mL注射器吸取培养基后冲洗 骨髓腔， 获得细胞悬液后在400g转速下离心5 min， 用红细胞裂解液去除红细胞， 将获得的骨 髓细胞转入100mm培养皿中进行体外培养， 培养基为含20％FBS、 1％双抗、 20ng/mL  GM‑CSF 和20ng/mL  LPS的DMEM条件培养基， 继续培 养1周后获得M1极性表型的骨髓来源巨噬细胞； 2)脱细胞基质的提取： 配制10mg/mL的海藻酸钠 溶液， 收集基质细胞与免疫细胞后按细 胞数1:1的 比例与海藻酸钠溶液混匀， 总细胞密度为5 ×106个/mL， 将含有免疫细胞的海藻 酸钠溶液用去除针头的1mL注射器吸取， 小心滴入20mM的CaCl2溶液中， 形成水凝胶 微球， 待 微球稳定后转入培养基中体外培养1周； 用液氮冷却水凝胶微球并迅速用研钵破碎， 加入海 藻酸降解酶使微球降解完全， 用去DNA酶与去RNA酶降解微球内的核酸， 于5000g转速下用 PBS反复离心 清洗3次， 在‑50℃下冻干获取脱细胞基质； 二)脱细胞基质复合水凝胶的制 备： 配制10mg/mL的透明质酸钠与10mg/mL的海藻酸钠 混合溶液， 加入10mg/mL的脱细胞基质后充分搅拌混匀， 将混合溶液用去除针头的1mL注射 器吸取后， 小心滴入20mM的CaCl2溶液中， 形成脱细胞基质复合水凝胶。 2.一种由权利要求1所制得的治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114939129 A 2治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及医疗卫生技术领域， 具体是指一种治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复 合水凝胶 及其制备 方法。 背景技术 [0002]乳腺癌(Breast  Cancer， BC)是女性中常见癌症， 三阴性乳 腺癌(Triple  Negative  Breast Cancer， TNBC)  是最具侵袭性和异质性的BC亚型。 临床上通过手术清除乳腺肿瘤 后， 仍存在较高的复发或转移风险， 其重要原因是手术无法将原位残留的肿瘤细胞彻底清 除。 TNBC独特的细胞表型、 侵袭性、 转移潜能以及受体、 靶点的缺乏， 使得化疗成为其首选治 疗方案， 然而与其它BC亚型相比， TNBC的预后效果最差， 其治疗干预需求仍未得到满足。 因 此急需开发出一种新型、 安全和高效的免疫 治疗方式， 以完 善TNBC预后治疗的研究工作。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方 法， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0004]为解决上述技术问题， 本发明提供的技术方案为： 治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基 质复合水凝胶的制备 方法， 具体包括以下步骤： [0005]一)脱细胞基质的制备： [0006]1)同种异体化细胞的提取： [0007]1A)基质细胞 的提取(以肿瘤相关成纤维细胞为例)： 将Balb/c小鼠肿瘤组织及癌 旁组织放入培养皿， 用含20％双抗(青霉素与链霉素)的PBS洗涤3次， 用剪刀将组织破碎并 置于50mL离心管中， 用5 ‑10mL 胶原酶在37℃下孵育消化1h， 经100 μm孔径的滤网过滤， 滤后 的细胞悬液转入50mL离心管中， 于200  g转速下离心3min， 摒弃上清液后加入10mL  PBS小心 吹打细胞， 继续离心3min， 吸去上清液后用含10％  FBS的培养基 吹散细胞并分装至培养皿 中进行体外培养， 细胞开始贴壁生长后， 用PBS小心清洗培养皿， 肿瘤相关成纤维细胞可贴 壁生长， 其它细胞随PBS滑落， 获得贴壁的肿瘤相关成纤维细胞并体外 培养扩增； [0008]1B)免疫细胞的提取(以 巨噬细胞为例)： 取Balb/c小鼠的股骨与胫骨， 去除皮肤与 肌肉组织后， 用含20％双抗的PBS洗涤3次， 用剪刀去除关节头， 用1mL注射器吸取培养基后 冲洗骨髓腔， 获得细胞悬液后在400g转速下离心5min， 用红细胞裂解液去除红细胞， 将获得 的骨髓细胞转入100mm培养皿中进行体外培养， 培养基为含20％FBS、 1％双抗、 20ng/mL  GM‑ CSF和20ng/mL  LPS的DMEM条件培养基， 继续培养1周后获得M1极性表型的骨髓来源巨噬细 胞； [0009]2)脱细胞基质的提取： 配制10m g/mL的海 藻酸钠溶液， 收集基质细胞与免疫细胞后 按细胞数1:1的比例与海藻酸钠溶液混匀， 总细胞密度为5 ×106个/mL,将含有免疫细胞的 海藻酸钠溶液用去除针头的1  mL注射器吸取， 小心滴入20mM的CaCl2溶液中， 形成水凝胶微 球， 待微球稳定后转入培养基中体外培养1周； 用液氮冷却水凝胶微球并迅速用研钵破碎，说　明　书 1/4 页 3 CN 114939129 A 3