(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210697062.7 (22)申请日 2022.06.20 (71)申请人 中国人民解 放军海军军医大学 地址 200433 上海市杨 浦区翔殷路80 0号 (72)发明人 罗建华　郭猛　刘秋燕　刘艳芳　 曹雪涛　 (74)专利代理 机构 上海申浩 律师事务所 31280 专利代理师 李阳 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C07K 14/715(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01)A61K 39/00(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种自分泌 IL2Rβγ激动剂的MSLN-CAR-NK 细胞及其应用 (57)摘要 本发明涉及生物医药技术领域， 具体是一种 自分泌IL2Rβγ激动剂并靶向肿瘤抗原MSLN的 CAR‑NK细胞及其应用。 其中靶向MSLN的嵌合抗原 受体与IL2Rβ γ‑A并联组成共表达的多顺反子 结构。 IL2Rβγ ‑A为计算机基于IL2Rβγ构象设 计合成的人工多肽， 其与IL2Rβγ的亲和 力较天 然IL‑2显著提高； 且与IL ‑2Rα无结合活性， 避免 了天然细胞因子对调节性T细胞的激活效应， 从 而显著提升CAR ‑NK细胞的杀伤活性。 本发明提高 了靶向MSLN  CAR‑NK细胞的体内外抗瘤效应， 可 用于MSLN阳性的胰腺癌、 卵巢癌、 宫颈癌等恶性 肿瘤的治 疗。 权利要求书2页 说明书60页 序列表35页 附图3页 CN 115124627 A 2022.09.30 CN 115124627 A 1.一种靶向MSLN的嵌合抗原受体， 其特征在于， 包括信号肽、 抗原结合结构域、 铰链区、 跨膜结构域和胞内结构域； 所述的信号肽为选自下组的蛋白的信号肽： OSM信号肽， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.1 所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； IL ‑2信号肽， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 核 苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； HSA信号肽， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 核苷酸序列 如SEQ ID NO.6所示； CD8α 信号肽， 其氨 基酸序列如SEQ  ID NO.7所示， 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.8所示； 胰岛素信号肽， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.9所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.10 所示； 胰蛋白酶原2信号肽， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.11所示， 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.12所示； 所述的抗原结合结构域为可特异性结合MSLN  scFv， 其构造为VH ‑linker‑VL或VL‑ linker‑VH两种构型之一， linker的氨基酸序列为3次重复序列(G4S)3或4次重复序列 (G4S)4； 其中VH的氨基酸序列分别如SEQ  ID NO.13～18所示， 对应的核苷酸序列分别如SEQ   ID NO.19～24所示； VL的氨基酸序列如SEQ  ID NO.25～30所示， 对应的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.31～3 6所示； 所述的铰链区将嵌合抗原受体的细胞外结构域与跨膜区连接， 铰链区选自以下蛋白： CD8α， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.40所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.41所示； CD28， 其氨基 酸序列如SEQ  ID NO.42所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.43所示； IgG1， 其氨基酸序列如SEQ   ID NO.44所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.45所示； IgG4， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.46所 示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.47所示； 所述的跨膜结构域选自以下蛋白： CD4， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.48所示， 核苷酸序 列如SEQ ID NO.49所示； CD8α， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.50所示， 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.51所示； CD28， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.52所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.53所示； NKG2D， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.54所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.55所示； 所述的胞内结构域由以下分子的信号转导结构域或共刺激结构域中的2～4个串联组 成， 包括： CD28， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.56所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.57所示； CD137， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.58所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.59所示； CD3ζ， 其氨 基 酸序列如SEQ  ID NO.60所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.61所示； DAP10， 其氨基酸序列如SEQ   ID NO.62所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.63所示； DAP12， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.64所 示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.65所示； IL2Rγ， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.66所示， 核苷酸 序列如SEQ  ID NO.67所示； ICOS， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.68所示， 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.69所示； OX40， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.70所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.71所示； NCR3， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.72所示， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.73所示。 2.根据权利要求1所述的靶向MSLN的嵌合抗原受体， 其特征在于， 信号肽序列如SEQ  ID  No.7所示； 抗原结合结构域序列如SEQ  ID NO.37、 SEQ ID NO.38或SEQ  ID NO.39所示； 铰链 区序列如SEQ  ID No.40所示， 跨膜结构域序列如SEQ  ID No.50所示； 胞内结构域序列由SEQ   ID NO.58与SEQ  ID NO.60串联构成。 3.一种IL2Rβ γ激动剂IL2Rβ γ ‑A， 其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ  ID NO.74～81所 示， 对应的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.82～89所示。 4.一种共表达如权利要求1所述的靶向MSLN的嵌合抗原受体与权利 要求3所述的IL2 Rβ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115124627 A 2γ‑A的多顺反子结构， 其特征在于， 嵌合抗原受体与IL2Rβ γ ‑A序列直接通过P2A、 T2A、 E2A 或F2A肽进行连接； 所述的多顺反子结构的核苷酸序列选自SEQ  ID NO.90～93中的任意一 条。 5.如权利 要求1所述的靶向MSLN的嵌合抗原受体结构、 或如权利 要求2所述的IL2 Rβ γ‑ A结构、 或如权利要求4所述的共表达靶向MSLN的嵌合抗原受体与IL2Rβ γ ‑A的多顺反子结 构在制备自分泌I L2β γ特异性激动剂并靶向肿瘤抗原MSL N的CAR‑NK细胞系中的应用。 6.一种慢病毒载体， 其特征在于， 其包含如权利要求1所述的靶向MSLN的嵌合抗原受体 与如权利要求3所述的I L2Rβ γ‑A的氨基酸与核苷酸序列。 7.一种基因修饰的自然杀伤细胞， 其特征在于， 其基因组中整合有如权利要求1所述的 靶向MSLN的嵌合抗原受体与分泌如权利要求3所述的IL2Rβ γ ‑A的核苷酸序列， 或如权利要 求4所述的多顺反子核苷酸序列。 8.如权利要求1所述的靶向MSLN的嵌合抗原受体结构、 如权利要求3所述的IL2Rβ γ ‑A 结构、 如权利要求4所述的共表达靶向MSLN的嵌合抗原受体与IL2Rβ γ ‑A的多顺反子结构、 如权利要求6所述的慢病毒载体、 如权利要求7所述的自然 杀伤细胞在制备治疗肿瘤的药物 或制剂中的应用。 9.一种如权利要求7所述的的自然杀伤细胞的构建方法， 其特征在于， 是利用如权利要 求1所述的靶向MSLN的嵌合抗原受体结构、 或如权利要求3所述的IL2Rβ γ ‑A结构、 或如权利 要求4所述的共表达靶向MSLN的嵌合抗原受体与IL2Rβ γ ‑A的多顺反子结构， 以NK92细胞系 为宿主细胞建系。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115124627 A 3