(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210704124.2 (22)申请日 2022.06.21 (71)申请人 泰州市人民医院 地址 225300 江苏省泰州市海陵区海陵南 路399号 (72)发明人 华璐　颜大亮　万春华　王鹏　 (74)专利代理 机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 专利代理师 秦秋星 (51)Int.Cl. C07K 14/47(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 5/09(2010.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 38/17(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种ASCC3多肽构建及其 抗肝癌活性应用 (57)摘要 本发明公开了一种ASCC3多肽的构建及其抑 制Wnt/β‑catenin通 路及肝癌 细胞增殖的活性； 其中， 一种ASCC3多肽的构建的序列， 其包括， 其 编码蛋白序列SEQID  NO:1， 其核苷酸序列如SEQ   ID NO:2； 一种ASCC3多肽的构建方法， 其包 括， 人 工合成并ASCC3多肽编码序列与pCMV ‑Flag真核 表达载体在T4连接酶作用下连接， 获得重组质 粒； 将所述重组质粒转染肝癌细胞。 本发明利用 多种功能手段分析其对肝癌中Wnt/β ‑catenin 通路及癌细胞增殖的拮抗作用。 在细胞生物学层 面证明了 此ASCC3多肽具有拮抗Wnt /β‑catenin 通路并抑制肝癌细胞增殖的潜能。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115417919 A 2022.12.02 CN 115417919 A 1.一种ASC C3多肽， 其特 征在于， 其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列为： 1     LYNFSHFNPV  QTQIFHTLYH 21    TDCNVLLGAP TGSGKTVAAE 41    LAIFRVFNKY  PTSKAVYIAP 61    LKALVRERMD  DWKVRIEEKL 81    GKKVIELTGD  VTPDMKSIAK 101   ADLIVTTPEK WDGVSRSW QN 121   RNYVQQVTIL IIDEIHLLGE 141   ERGPVLEVIV  SRTNFISSHT 161   EKPVRIVGLS  TALANARDLA 181   DWLNIKQMGL FNFRPSVRPV 201   PLEVHIQGFP。 2.根据权利要求1所述的一种ASC C3多肽， 其特 征在于， 其编码cDNA序列为： 1     CTTTATAACT TCAGCCACTT CAACCCGGTA CAGACTCAGA  TATTCCATAC ACTTTACCAT 61    ACCGACTGCA ATGTCCTGCT TGGAGCACCG ACCGGGAGTG GAAAAACTGT CGCCGCCGAA 121   TTGGCGATAT TCCGAGTCTT CAATAAATAT CCAACTAGTA AGGCGGTTTA TATTGCGCCC 181   TTGAAAGCTC TGGTACGCGA  AAGAATGGAC GACTGGAAAG TCAGAATCGA GGAGAAGCTG 241   GGGAAGAAAG TGATTGAGTT GACTGGAGAT GTGACGCCTG ACATGAAATC TATAGCCAAG 301   GCAGACCTCA TTGTGACAAC GCCAGAGAAA TGGGACGGAG TTTCCAGATC CTGGCAAAAT 361   AGAAACTATG TGCAGCAAGT AACTATATTG ATTATCGACG AAATTCACCT GCTTGGTGAA 421   GAGAGAGGAC CTGTCTTGGA AGTAATAGTC AGCAGGACCA ATTTTATTTC TTCCCACACT 481   GAAAAGCCAG TTAGGATTGT CGGACTGAGT  ACCGCTCTCG CAAACGCCCG AGACCTTGCT 541   GACTGGCTTA ATATTAAGCA GATGGGTCTG TTTAATTTTA GGCCTAGCGT CCGCCCCGTA 601   CCTCTGGAAG TACACATACA  AGGATTCCCG。 3.一种如权利要求1所述ASCC3多肽的克隆构建及表达方法， 其特征在于， 包括合成拮 抗多肽的编码核酸序列， 并以限制性内切酶切割处理后， 与 表达载体混合， 加入连接酶缓冲 液和连接酶， 孵 育后获得重组表达载体。 4.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法， 其特征在于， 所述限制性内切酶包括 HindIII和KpnI。 5.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法， 其特征在于， 所述表达载体为pCMV ‑ Flag。 6.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法， 其特征在于， 所述表达载体经与所述编 码核酸序列相同限制性内切酶线性 化处理。 7.根据权利要求3所述的克隆构建及表达方法， 其特征在于， 所述连接酶缓冲 液和连接 酶分别为T4  DNA连接酶 缓冲液和T4  DNA连接酶。 8.权利要求1所述ASC C3多肽在抗肝癌活性中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115417919 A 2一种ASCC3多肽构建及其抗肝癌活性应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物工程技术领域， 涉及ASCC3多肽的构建及其抗原发性肝癌的活性， 具体是明确一种拮抗ASC C3多肽及其应用于原发性 肝癌的靶向治疗。 背景技术 [0002]原发性肝癌(简称肝癌)是世界范围内高发的恶性肿瘤， 在所有肿瘤中发病率居第 6位， 其相关死亡率则高居第3位。 由于病毒性肝炎的流行和黄曲霉素污染等原因， 肝癌在我 国尤为高发， 发病率和死亡率在所有肿瘤中分居第5和2 位， 严重影响我国国民的健康。 肝癌 的临床治疗目前主要依赖于传统的手术治疗结合放疗和化疗， 患者一旦在治疗后发生复 发， 由于缺乏更多的治疗措施， 通常预后显著 不良。 因此， 开 发新的肝癌治疗手段， 对改善肝 癌患者的愈后及生存质量具有重要的意义。 肝癌的进程和 转移存在 复杂的分子调控机制， 其中Wnt/β ‑catenin作为重要的促癌信号通路， 在肝癌的发生发展中发挥举足轻重的地位， 目前大量研究表明Wnt/β ‑catenin通路的过度活化与肝癌的生长、 干细胞性、 转移和耐药均 存在密切联系。 因此， 靶向W nt/β‑catenin通路对肝癌的靶向治疗具有举足轻重的价 值。 [0003]Wnt/β‑catenin通路对肝癌的促进作用与β ‑catenin介导的转录和 基因表达存在 密切联系。 β ‑catenin在结合下游癌基因启动子区域后， 需要募 集多种表观遗传相关蛋白以 打开上述基因区域的结构， 促使RNA聚合酶等蛋白结合和信使RNA(mRNA)的转录。 因此， 靶向 β‑catenin关键转录调控蛋白可以作为一种替代靶向措施抑制β ‑catenin介导的转录。 我们 近期通过研究发现ASCC3是一个重要的β ‑catenin促肝癌发生转录活化基因。 ASCC3具有DNA 解旋酶活性， 可以收β ‑catenin募集后 结合DNA并诱导DNA的解旋和松散， 促进基因的转录。 基于此， 我们发明了一种干扰ASCC3与β ‑catenin结合的多肽， 并发现此多肽可以抑制ASCC3 与β‑catenin靶基因启动子 区域的结果， 从而拮抗β ‑catenin靶基因的转录， 抑制肝癌的进 程。 该ASCC3多肽具有特异性抑制肿瘤中β ‑catenin转录活性的功能， 具有良好的肿瘤特异 性和靶向性， 在肝癌的临床靶向治疗中具有广阔的应用开发前 景。 发明内容 [0004]作为本发明其中一个方面， 本发明克服现有技术中存在的不足， 提供一种ASCC3多 肽的构建的序列， 其编码蛋白序列SEQID  NO:1， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:2； 一种ASCC3多 肽的构建方法， 其包括， 人工合成并ASCC3多肽编码序列与pCMV ‑Flag真核表达载体在T4连 接酶作用下连接， 获得重组质粒； 将所述重组质粒转 染肝癌细胞。 本发 明利用多种功能手段 分析其对肝癌中Wnt/β ‑catenin通路及癌细胞增殖的拮抗作用。 在细胞生物学层面证明了 此ASCC3多肽具有拮抗 Wnt/β‑catenin通路并抑制肝癌细胞增殖的潜能。 [0005]具体为： 一种ASC C3多肽的构建序列， 其cDNA序列和表达的多肽氨基酸序列：说　明　书 1/4 页 3 CN 115417919 A 3