(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210706286.X (22)申请日 2022.06.21 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:C202 2100 2022.05.31 CCTCC NO:C202 2105 2022.05.31 (71)申请人 中国人民解 放军空军 军医大学 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西 路127号 (72)发明人 高天文　郭伟楠　刘影　 (74)专利代理 机构 重庆智诚达 邦专利代理事务 所(普通合伙) 50289 专利代理师 龚世妍 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 5/071(2010.01)A61K 39/00(2006.01) A61K 38/21(2006.01) A61K 39/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种用于治疗黑素瘤的细胞株及其多效价 全细胞疫苗与使用方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于治疗黑素瘤的细胞 株及其多效价全细胞疫苗与使用方法， 涉及生物 疫苗领域， 所述多效价全细胞疫苗包括ZJMM ‑45 和FLFMM ‑34两株同种人黑素瘤细胞株， 所述 ZJMM‑45和FLFMM ‑34细胞株按1:1的摩尔比混合， 该疫苗可以针对汉族人群增加恶性黑素瘤疫苗 的特异性抗肿瘤免疫反应， 明显改善患者的总生 存率。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 115074328 A 2022.09.20 CN 115074328 A 1.一种用于治疗黑素瘤的细胞株， 其特征在于， 所述细胞株由ZJMM ‑45同种人黑素瘤细 胞株， 保藏号为CCTCC  NO:C2022105和FLFMM ‑34同种人黑素瘤细胞株， 保藏号为CCTCC  NO: C2022100组成。 2.一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述多效价全细胞疫苗包 括ZJMM‑45同种人黑素瘤细胞株和FLFMM ‑34同种人黑素瘤细胞株， 所述ZJMM ‑45同种人黑素 瘤细胞株的保藏号为CCTCC  NO:C2022105， 所述FLFMM ‑34同种人黑素瘤细胞株的保藏号为 CCTCC NO:C2022100。 3.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 多效价全细胞疫苗用于治疗黑素瘤。 4.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 多效价全细胞疫苗中的ZJM M‑45细胞株和FLFM M‑34细胞株按1:1的摩尔比混合。 5.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 制备方法如下： a、 将处于对数生长期的ZJMM ‑45和FLFMM‑34两株同种人黑素瘤细胞， 按1:1比例混合， 然后用20 0目细胞筛网过 滤； b、 在37℃的条件下， 将过滤得到 的细胞以总剂量80Gy， 每日20Gy的连续分量照射方式 在60Co下连续辐照4天， 达到累计照射剂量后检测细胞活性， 确 定细胞已灭活后 分装冻存， 即得到抑制或预防黑素瘤的全细胞疫苗。 6.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 多效价全细胞疫苗每支含2.0 ‑3.0×107个细胞， 分装后采用。 7.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 ZJMM‑45的制备 方法包括以下步骤： a、 分离： 切除临床诊断为恶性黑素瘤淋巴结转移的患者的腋窝淋巴结受累细胞， 淋巴 结组织切除后行组织病理检查， 确诊为 黑素瘤淋巴结转移； 培养： 在无菌条件下， 将新鲜淋巴结组织肿瘤标本浸泡在添加有抗生素溶液的无血清 培养液中， 去除脂肪、 结缔组织及坏死瘤组织， 清洗2次后将其剪成1mm3的小块， 用 浓度为 0.2％复合胶原酶于37℃消化组织块， 3h后组织块分散而失去 形状， 加入含10％胎牛血清的 DMEM稀释消化液； 收集： 收集稀释后的消化液， 于1000r/min， 5min的条件下去除上清液， 无血清培养基离 心漂洗， 将细胞转至不含血清的MCDB 153与L‑15以4： 1配制成的基础培养基中， 培养基中添 加添加剂： 10ng/ml  EGF、 10ng/ml  ITS， 培养5天， 5天后加入7％胎牛 血清继续培 养； b、 进行体外培养建立细胞系： 在差速贴壁纯化后传代培养， 通过0.25％胰蛋白酶消化 每周传代 2次至70代， 将该细胞命名为ZJM M‑45。 8.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 FLFMM‑34的制备 方法包括以下步骤： a、 分离： 切除临床诊断为恶性黑素瘤淋巴结转移的患者的腋窝淋巴结受累细胞， 淋巴 结组织切除后行组织病理检查， 确诊为 黑素瘤淋巴结转移； 培养： 在无菌条件下， 将新鲜淋巴结组织肿瘤标本用磷酸盐缓冲盐水加抗生素溶液进 行冲洗后， 用剪刀将组织切成约1mm3的碎片， 随后组织移植到培养瓶中， 瓶内含有角质形成权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115074328 A 2细胞‑SFM培养基， 添加10％胎牛血清、 牛垂体提取物、 重组人表皮生长因子和谷氨 酰胺进行 培养； b、 进行体外培养建立细胞系： 在差速贴壁纯化后传代培养， 通过0.25％胰蛋白酶消化 每周传代 2次至110代， 将该细胞命名为FLFM M‑34。 9.根据权利要求2所述的一种用于治疗黑素瘤的多效价全细胞疫苗， 其特征在于， 所述 ZJMM‑45和FLFM M‑34的细胞株来源于中国汉族女性。 10.一种用于治疗黑素瘤的多 效价全细胞疫苗的使用方法， 其特征在于， 多 效价全细胞 疫苗与卡介苗、 IFN ‑α 1b联合使用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115074328 A 3