(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210729772.3 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 北京顺元天生物制品有限公司 地址 100000 北京市延庆区中关村延庆园 东环路2号楼 2152室 (72)发明人 王正好　赵理　 (51)Int.Cl. C07K 16/18(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 临床血液免疫细胞的制备方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及临床血液免疫细胞的制备方法 及其应用。 本发明提供了一种制备并扩增NK细胞 的方法及由该方法获得NK细胞， 验证了所述NK细 胞具有较好的杀伤肿瘤能力， 该NK细胞与β ‑ catenin单克隆抗体联用后， 能够显著的抑制肿 瘤在小鼠体内的生长， 具有极好的治疗肿瘤效 果。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 115124619 A 2022.09.30 CN 115124619 A 1.一种β‑catenin单克隆抗体， 其特征在于该抗体为β ‑catenin‑2D13， 该单抗的轻链可 变区序列为： DIVITQRPALMAASPGEKVTITCAEYKHHAELGHVWYQQKSGISPKPWIYRSFIYKGGVPARFSGSGSGTSYS LTITSMEAEDAATYYCNTWDWFTLPFGAGTKLELK 重链可变区序列为： EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSFPGFNWIKQRPGQGLEWIGPGLQRLFHHCCFDMRWGKATLTA DKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGPDDVCQHWGLGT TLAVSS。 2.如权利要求1所述的β ‑catenin单克隆抗体在制备用于治疗肺癌的药物组合物中的 用途。 3.如权利要求2所述的用途， 其特 征在于所述组合物中还 含有药学上可接受的载体。 4.如权利要求3所述的用途， 其特 征在于所述载体还 含有防腐剂。 5.NK细胞联合β ‑catenin单克隆抗体在制备用于治疗癌症肺癌的药盒中的用途； 其 中， β‑catenin单克隆抗体为β ‑catenin‑2D13， 该单抗的轻链可变区序列为： DIVITQRPALMAASPGEKVTITCAEYKHHAELGHVWYQQKSGISPKPWIYRSFIYKGGVPARFSGSGSGTSYS LTITSMEAEDAATYYCNTWDWFTLPFGAGTKLELK 重链可变区序列为： EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSFPGFNWIKQRPGQGLEWIGPGLQRLFHHCCFDMRWGKATLTA DKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGPDDVCQHWGLGT TLAVSS； 其中NK细胞的制备方法为： 分离外周血单核细 胞， 以无血清的PRMI ‑1640培养基悬浮沉 淀细胞加入到先包被羊抗鼠IgG于塑料平皿中， 用含1％FCS的PBS室温下封闭15分钟， 再用 PBS洗3次， 将与anti ‑CD3孵育2h的细胞加入包被好的平皿中， 4℃2h， 轻吸细胞悬液， 用NK   MACS GMP培养基培养基重悬单核细胞， 加入重组人IL ‑2和IL‑15， 混匀后注射入小培养袋 中， 置于37℃孵箱静置培养； 第3天， 补充入半量的NK  MACS GMP培养基和半量的重组人IL ‑2 和IL‑15， 混匀后继续培养； 第4 天， 把小培养袋中的培养液平均分配到两个大培养袋中继续 培养， 每3天向每个大培养袋中补充NK  MACS GMP培养液和重组人IL ‑2， 总共培养14 d， 即收 集获得增殖后的NK细胞。 6.如权利 要求5所述的用途， 其特征在于所述β ‑catenin单克隆抗体本身为药物组合物 的形式， 其含有药 学上可接受的载体。 7.如权利要求6所述的用途， 其特 征在于所述载体还 含有防腐剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115124619 A 2临床血液免疫细胞的制备方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物领域， 更具体的涉及免疫细胞领域， 涉及临床血液免疫细胞的制 备方法及其应用。 背景技术 [0002]NK细胞于40年前被发现， 主要来源于骨髓， 主要存在于血液及淋巴器官中， 不需要 预先致敏， 不依赖抗体和补体， 也不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制， 能直接杀伤肿 瘤细胞， 在机体早期抗肿瘤和免疫监视中具有重要作用。 在肿瘤免疫中， NK细胞属于非特异 性免疫细胞， 表面的标志主要有CD3， CD56， CD16等， 健康人群外周血中， 约占淋巴细胞总数 的5％～15％， 构成了机体的第一道免疫杀伤防线， 通常情况处于休眠状态， 信号因子激活 后， 会渗透 到组织中攻击肿瘤 细胞和病毒感染细胞。 [0003]NK细胞具有杀伤细胞活化受体(killeractivato ‑ryreceptor， KAR)、 杀伤细胞抑 制受体(killerinhibi ‑toryreceptor， KIR)、 杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin ‑ likereceptors， KLR)和Fcγ受体(CD16)共4种受体， 前3种受体可抑制或激活NK细胞， 使之 识别自身组织细胞与体内异常组织细胞的能力， 第4种受体主要识别NK细胞表面的IgG1和 IgG3标志物， 介导NK细胞识别被抗体包被的靶细胞， 从而发挥抗体依赖性细胞介导的细胞 毒作用(antibodyde ‑pendentcell ‑mediatedcytotoxicity， ADCC)， 进而杀伤与I gG抗体特 异性结合的肿瘤。 NK细胞具有较广的抗瘤谱， 可杀伤同系、 同种或异种肿瘤细胞， 其杀伤靶 细胞的机制可能有: ①释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞坏死或凋亡。 ②通过死亡受体调节 诱导靶细胞凋亡。 ③分泌多种效应性细胞因子对抗 转移肿瘤。 [0004]④激发继发肿瘤免疫效应。 [0005]Wnt/β‑eatenin信号转导通路异常与人类疾病有关， 包括肿瘤、 骨质疏松、 衰老和 退化障碍等。 因此， 对Wnt/β ‑eatenin信号转导通路的研究不仅有助于理解人类疾病的发生 机制， 而且可以为疾病的治疗提供一系列新的靶点。 目前研究证实， 至少有6种Wnt蛋白 (Wntl、 Wnt2、 Wnt3、 Wnt3a、 Wnt8和Wnt8b)可以激活Wnt/β ‑eatenin信号转导通路。 Wnt/β ‑ eatenin信号转导通路的活化由细胞质中β ‑eatenin蛋白水平决定。 正常情况下， 细胞质中 β‑eatenin由泛素蛋白酶体介导呈降解状态而维持低水平表达， 泛素蛋白酶体是由轴蛋白 (axin)、 大肠腺瘤息肉蛋白、 糖原合成激酶3β和酪蛋白激酶let等组成的多蛋白复合物， 包 括泛素激活酶(E1)、 泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。 GSK ‑β通过磷酸化Ser3、 Ser3和 Thr4标记蛋白， CK1α仅通过磷酸化Ser45标记蛋 白， 使其被E3亚基β ‑转导素重复蛋白识别， 介导β‑catenin分子的降解， 26S的蛋白酶体也随之被降解。 Wnt蛋白通过与细胞表 面受体复 合物跨膜蛋白/共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白结合启动细胞内β ‑catenin的聚集。 但 是， 目前对于Wnt蛋白结合Fz/L RP受体后引起细胞信号转导的机制还不十 分清楚。 多 数学者 认为， 2者结合后， 受体复合物下游蛋白即细胞质散乱蛋白被磷酸化， 抑制GSK ‑3β和CK1α 的 活性， 并通过固定axin蛋白， 破坏多 蛋白复合物的形成， 最终导致非磷酸化β ‑catenin在细 胞质中聚集， 并逃脱β ‑TrCP的识别， 避免了被降解的过程， 进而转位到细胞核。 在细胞核内，说　明　书 1/7 页 3 CN 115124619 A 3