(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210417539.1 (22)申请日 2022.04.20 (71)申请人 西安交通大 学 地址 710049 陕西省西安市咸宁西路28号 (72)发明人 刘利英　李永伟　王伟　胡书刚　 王家麟　 (74)专利代理 机构 西安通大专利代理有限责任 公司 6120 0 专利代理师 张宇鸽 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种对非切片标本新生骨组织进行检测及 分析的方法 (57)摘要 本发明公开了一种对非切片标本新生骨组 织进行检测及分析的方法， 属于骨组织工程技术 领域。 该方法利用高分辨在体双光子激光扫描显 微成像系统对标本新生骨组织中的 Ⅰ型胶原、 荧 光标记的矿化结构进行荧光扫描检测得到骨基 质图像； 采用包括x轴、 y轴和z轴三个互相垂直的 轴的三维扫描方式， 利用所述高分辨在体双光子 激光扫描显微成像系统对新生骨组织样品进行 全层扫描， 通过扫描得到的荧光图像对新生骨组 织进行定量 分析。 本发明方法解决了硬组织切片 用于新生骨检测造成的骨组织标本浪费、 新生骨 组织显示不全面、 标记定位不确定及定量不准确 问题。 该方法操作 简单， 定量数据可靠， 能够全面 反应新生骨的情况。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 114965390 A 2022.08.30 CN 114965390 A 1.一种对非切片标本新 生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)结合胶原二次谐波成像和所标记矿化结构的荧光物质激发光波长， 利用高分辨在体 双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织中的 Ⅰ型胶原及矿化结构进行荧光 扫描检测， 得到胶原及矿化结构的荧 光激发条件； 其中， 所标记矿化结构的荧光物质为钙黄绿素和茜素红， 钙黄绿素标记的矿化组织吸 收波长为5 03‑555nm， 茜素红标记的矿化物吸 收波长为578 ‑634nm； 2)在胶原及矿化结构的荧光激发条件下， 采用包括x轴、 y轴和z轴三个互相垂直的轴的 三维扫描方式， 利用高分辨在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织样 品进行全层扫描， 获取N个子层的胶原及矿化结构的荧 光图像； 3)利用所述N个子层的胶原及矿化结构的荧光图像， 重建骨组织样品中骨基质的三维 图像； 4)根据所述步骤3)中重建的胶原及矿化结构的三维图像， 得到所述非切片标本新生骨 组织样品中骨基质的形态结构， 从而完成对非切片标本新生骨组织样品的定性和定量分 析。 2.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 步骤1)中， 进行荧光扫描检测前， 将颅骨缺损标本进行表面处理和修整， 保证成像 效果， 然后将其置于载玻片上， 得到非切片标本新生骨组织， 用于观 察成像； 其中， 表面处理 和修整为将表面肌肉、 骨膜等软组织全部剔除， 同时修剪标本周围骨组织， 确保新生骨部位 在同一水平面。 3.根据权利要求2所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 用生物胶或者胶布将处理好的标本固定于载玻片上， 在缺损区域滴 1滴PBS， 将合适 大小的盖玻片置 于缺损上 方， 然后置 于载物台上进行观察成像。 4.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 步骤1)中， 所述胶原及矿化结构的荧 光激发条件为： 激发光波长940nm。 5.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 步骤1)中， 胶原二次谐波成像吸 收波长为 465‑475nm。 6.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 步骤2)中， 所述全层扫描是指： 将圆形缺损 x轴、 y轴方向所固定的平面， 在z轴方向 上的N个子层进行扫描， N为大于5的整数， 在对每个子层进行扫描的过程中， 激发所述新生 骨组织样品中每个子层的胶原及矿化结构产生荧光， 从而获取N个子层的胶原及矿化结构 的荧光图像。 7.根据权利要求1所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 步骤3)中， 所述N个子层的胶原及 矿化结构的荧光图像重 建处理为： 将扫描得到的N 个子层的胶原或矿化结构图片使用软件分别得到胶原或矿化结构荧光三 维图像， 然后对胶 原或者矿化组织的荧光进 行定量， 得到的数值即为该非切片标本中胶原或矿化组织的定量 参数。 8.根据权利要求7所述的一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 其特 征在于， 所述软件为 leica Application Suite X软件或Ima ge J软件。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114965390 A 2一种对非切片标本新生骨组织进行检测及分析的方 法 技术领域 [0001]本发明属于骨组织工程技术领域， 具体涉及一种对非切片标本新生骨组织进行检 测及分析的方法。 背景技术 [0002]新生骨组织的评估是骨修复研究中关注的重点， 骨组织是由骨细胞和周围的骨基 质构成， 骨基质包含 Ⅰ型胶原和周围的矿化结构。 胶原具有自发荧光的特性， 同时周围的矿 化结构也可以通过荧光物质与钙离子络合来 实现荧光标记。 目前新生骨检测的主要办法就 是对动物生前进行荧光物质标记， 然后 将其处死， 取标本， 并制作硬组织切片在荧光显微镜 或者激光共聚焦显微镜下观察(Tissue  engineering  Part B:Reviews,2010,16， 209 ‑ 217.)， 然后根据荧光的定量或者不同荧光之间的距离来评估新骨生成的速度(Frontiers   in Bioengineering  and Biotechnology,2020,8.)， (RSC  Advances.2020， 10， 25652 ‑ 25661.)。 [0003]目前评估新生骨组织的方法需要将标本浸塑制作为硬组织切片， 操作繁琐， 且标 本无法进行其他生物学检测， 造成骨组织标本和资源的浪费； 且现有方法只关注新生骨骨 基质中的矿化结构， 无法全面显示骨基质中的 Ⅰ型胶原， 更无法将二者结合在一起进行显 像； 同时标记的新生骨矿化结构位置具有不确定性， 所以某一个层面的切片不一定有激发 荧光产生， 容易遗漏或误判； 此外， 尽管针对切片标记的新生骨也有一些定量分析的办法， 但是其得到的数据只能代表一个层面的情况， 并不能代表新生骨的全貌， 无法对新生骨进 行准确的量化评估。 现有技术提供了一种对新生骨组织进行分析 的方法， 是将骨组织样品 进行切片， 再进行染色处理， 然后才能在双光子共聚焦显微镜下进 行观察骨的形态， 但其操 作繁琐， 仍需要 进行切片。 发明内容 [0004]为了克服上述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种对非切片标本新生骨 组织进行检测及分析 的方法， 为了解决硬组织需要切片， 用于新生骨检测造成的骨组织标 本浪费， 新 生骨组织显示 不全面、 标记定位 不确定及定量 不准确问题。 [0005]为了达到上述目的， 本发明采用以下技 术方案予以实现： [0006]本发明公开了一种对非切片 标本新生骨组织进行检测及分析的方法， 包括以下步 骤： [0007]1)结合胶原二次谐波成像和所标记矿化结构的荧光物质激发光波长， 利用高分辨 在体双光子激光扫描显微成像系统对非切片标本新生骨组织中的 Ⅰ型胶原及矿化结构进 行 荧光扫描检测， 得到胶原及矿化结构的荧 光激发条件； [0008]其中， 所标记矿化结构的荧光物质为钙黄绿素和茜素红， 钙黄绿素标记的矿化组 织吸收波长为5 03‑555nm， 茜素红标记的矿化物吸 收波长为578 ‑634nm； [0009]2)在胶原及矿化结构的荧光激 发条件下， 采用包括x轴、 y轴和z轴三个互相垂直的说　明　书 1/4 页 3 CN 114965390 A 3