ICS 65.020 CCS B 05 云 53 南 省 地 方 标 准 DB53/T 1073—2021 甘蔗杂交育种独立亲本系统的创制及培育 技术规程 2021 - 12 - 10 发布 云南省市场监督管理局 2022 - 03 - 10 实施 发 布 DB53/T 1073—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。 本文件主要起草人：吴才文、胡鑫、刘家勇、赵俊、杨昆、夏红明、赵培方、昝逢刚、刘新龙、苏 火生、董立华、经艳芬、田春艳、覃伟、陆鑫、吴转娣、姚丽、桃联安、赵丽萍、赵勇、陈学宽。 I DB53/T 1073—2021 甘蔗杂交育种独立亲本系统的创制及培育技术规程 1 范围 本文件规定了甘蔗杂交育种独立亲本系统创制中涉及的优良性状界定、独立亲本系统创制及独立亲 本系统培育等技术要求。 本文件适用于甘蔗杂交育种新独立亲本系统的创制与培育。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 DB53/T 734 甘蔗实生苗培育技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 甘蔗属原种 original ancestor of Saccharum L. 甘蔗属内未经过人工杂交及驯化，保持原有种性的栽培原种及野生种简称甘蔗属原种。本规程甘蔗 属栽培原种包括热带种（S. officinarum）、中国种（S. sinense）和印度种（S. barberi）3个种，甘蔗属 野生种包括割手密（S. spontaneum）和大茎野生种（S. robustum）2个种。 3.2 新原种 new original ancestor of Saccharum L. 不 包 含 在 世 界 公 认 的 POJ2878 和 Co290亲 本 系 统 中 的 甘 蔗 属 栽 培 原 种 9 个 无 性 系 （ B.Hitan 、 B.Cheribon、Chunnee、Crystalina、Lahaina、Loethers、FiJi、K.Boothan、W.Transparent）和野生种2个 无性系（S.spont/Co、S.spont/G），其余所有原种个体均称为新原种。 3.3 异质率 heterogeneity rate 新独立亲本系统与现有POJ2878和Co290系统比较，采用系谱法计算使用的新原种的数量占系统中 甘蔗属原种数的百分率。 3.4 杂交伴侣 partner 不同无性系个体之间进行的杂交，杂交的双方互为杂交伴侣。 3.5 性状互补 character complementation 指亲本一方的优点应在很大程度上弥补另一亲本的缺点，便于创制出具有双亲优良性状的子代，如 高产与高糖、中大茎与多茎、大茎与多茎、抗病与抗虫等。 1 DB53/T 1073—2021 4 优良性状界定 早熟、高产、高糖、中大茎、大茎、有效茎中等以上，抗病、抗虫和抗逆等达中抗以上，具体要求 见表1。 表1 早熟 高产 优良性状 高糖 茎径（cm） 茎数（茎） 抗性 主要病虫害（黑穗 病、锈病、花叶病、 成熟初期 11 月～12 月甘蔗平均糖分达 13.5% 甘蔗蔗糖分比对照 单位面积比对照种 增产 5%及以上 增加 0.5 个百分点及 2.5≤中大茎˂3.0 3≤中等≤4 大茎≥3.0 多茎≥5 以上 稍腐病等，蚜虫、螟 虫、粘虫、蓟马等） 及逆境（旱害、冻害 及寒害等）达中抗及 以上。 5 独立亲本系统创制 5.1 新原种的选择 选择至少具有一个优良性状的新原种。 5.2 杂交伴侣的选配 5.2.1 母本与父本 栽培原种间杂交，以优良性状多的为母本，优良性状较少的为父本。 甘蔗属内栽培原种与野生种杂交，以栽培原种为母本，以性状互补性好的野生种为父本。 5.2.2 亲本血缘比例 提供生产亲本，野生血缘比例不超过25 %。如提供生产利用的亲本为F2代种时，其4 个原种中最多 有1 个为野生种；若提供生产利用的亲本为F3代种时，其8 个原种中最多有2 个为野生种。 5.3 对等杂交 杂交伴侣各自所含原种数量及其遗传代数完全相等的杂交，方法如下： a) 原种与原种间杂交产生的高贵化 F1 代种； b) 高贵化 F1 代相互杂交（F1×F1），获得更高贵化的 F2 代种； c) 以此类推，获得 F3 代或更高代种的杂交方式。 5.4 2 独立亲本系统确定 DB53/T 1073—2021 对等杂交培育产生的新独立亲本系统所含新原种与传统的POJ2878和Co290系统没有或极少重复， 异质率达80 %及以上，遗传性稳定、优良性状多的F2及以上代数的亲本系统。 6 独立亲本系统培育 6.1 母本杀雄 50℃水浴3 min～ 5 min杀雄，不应自交。 6.2 隔离 遮蔽或罩住杂交伴侣整个花穗（1.5 m～2.0 m高），不应串粉。 6.3 杂交 在隔离罩中将父本花穗置于母本上方，母本花穗顶部置于父本花穗下半部约1/3 处～1/2 处，每日轻 摇父本2 次～3 次授粉。 6.4 实生苗培育 参照DB53/T 734执行。 6.5 后代选择 对各级杂交获得的种子培育实生苗，经田间试验评价，在含有亲本主要特性的前提下，选择优良性 状多的个体。 6.6 真实性鉴定 采用简单序列重复（Simple sequence repeat, SSR）分子标记技术，进行真实性鉴定，方法参见附录 A。 6.7 利用 已经通过真实性鉴定，达到遗传性稳定、工农艺性状和抗性性状要求指标的材料，F2代就可用于选 配杂交组合，提供甘蔗育种单位培育新品种利用。 3 DB53/T 1073—2021 附 录 A （资料性） 甘蔗杂交后代 SSR 真实性鉴定方法 A.1 仪器、耗材 A.1.1 仪器 主要仪器包含电子天平、酸度计、可调微量移液器、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核 酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、研钵等。 A.1.2 试剂 主要试剂包括十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、氢氧化钠、 氯 化 钠 、 三 氯 甲 烷 、 无 水 乙 醇 、 异 丙 醇 、 异 戊 醇 、 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 、 琼 脂 糖 、 β- 巯 基 乙 醇 （β-Mercaptoethanol）、丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、DNA分子量标准、dNTP混 合液、Ex-Taq DNA聚合酶、10×Ex-Buffer、SSR引物等。 A.2 真实性鉴定方法 A.2.1 参试样本采集 每份亲本和杂种后代材料取400 mg幼嫩叶片组织，放入2mL离心管中，样品直接提取DNA或保存于 -80℃冰箱备用。 A.2.2 CTAB法提取样本DNA CTAB提取样本DNA方法如下： a) 将甘蔗叶片剪成 1 cm 左右碎片，放入预冷的研钵中。加入液氮速冷，研磨成粉末，将冻粉转 移至 2 mL 离心管中； b) 向装有冻粉的离心管中加入等体积(w/v) 2×CTAB 提取缓冲液抽提缓冲液，65℃水浴 20 min， 间隔 4 min 颠倒混匀。 c) 将样品于 12 000 rpm 下离心 5 min，吸取上清液转入新的 2 mL 离心管中； d) 加入等体积的氯仿-异戊醇，轻缓颠倒离心管，充分混匀，12 000 rpm 离心 10 min； e) 吸取上清液转入新的离心管中，加入 2/3 倍体积的预冷异丙醇, 轻缓颠倒混匀后置-20℃冰箱 20 min； f) 取样品管，此时可见有絮状 DNA 沉淀，12 000 rpm 离心 10 min，弃上清液。DNA 沉淀用 75％ 乙醇漂洗 2 次，12 000 rpm 离心 1 min 后弃上清液，于室温下干燥 5 min； g) 加入 60 µL 1×TE 缓冲液溶解 DNA，可取 2 µL DNA 溶液用 1%琼脂糖电泳检测。提取的 DNA 溶液置于-20℃冰箱保存备用。 A.2.3 建立SSR-PCR反应体系和电泳检测 按下列方法建立SSR-PCR反应体系和电泳检测： a) 利用现代甘蔗商业品种、中国种、印度种、割手密、大茎野生种等 DNA 做为模板，对选择的 70 对 SSR 引物进行多态性分析，选择多态性高、稳定性好的 4 对引物，详见表 A.1。 4 DB53/T 1073—2021 表 A.1 SSR 真实性鉴定引物的序列信息 序号 SSR Marker Forward (5' to 3') Reverse (5' to 3') 1 SMC334BS CAATT CTGAC CGTGC AAAGA T CGATG AGCTT GATTG CGAAT G 2 SMC336BS ATTCT AGTGC CAATC CATCT CA CATGC CAACT TCCAA ACAGA C 3 mSSCIR74 GCGCA AGCCA CACTG AGA ACGCA ACGCA AAACA ACG 4 mSSCIR3 ATAGC TCCCA CACCA AATGC GGACT ACTCC ACAAT GATGC PCR 反应体系和条件:  PCR扩增反应体系（总体积20 µL）中各组分的终浓度和体积参照表A.2进行配制，可以依 据试验条件不同做相应调整； b) 表 A.2 SSR-PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积(µL) 10×Ex-Buffer 1× 2.0 dNTP（2.5 mmol/L） 0.25 mmol/L 2.0 上游引物（4 µmol/L） 0.2 µmol/L 1.0 下游引物（4 µmol/L） 0.2 µmol/L 1.0 DNA 模板 约 20 ng/µL 1.0 Ex-Taq 酶(5 U/µL) 0.05 U/µL 0.2 ddH2O 12.8  PCR的反应程序参照表A.3，其中退火温度依据不同引物的Tm值作相应调整，PCR程序结 束后扩增产物于4℃保存。 表 A