ICS 11.220 CCS B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3283—2021 猪血凝性脑脊髓炎病毒检测 TaqMan 荧光定量 PCR 法 TaqMan quantitative PCR assay for detection of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus 2021 - 11 - 26 发布 吉林省市场监督管理厅 2021 - 12 - 15 实施 发 布 DB22/T 3283—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的 规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本文件起草单位：吉林大学。 本文件主要起草人：贺文琦、李姿、兰云刚、赵魁、关继羽、陆慧君、高丰。 I DB22/T 3283—2021 猪血凝性脑脊髓炎病毒检测 TaqMan 荧光定量 PCR 法 1 范围 本文件描述了猪血凝性脑脊髓炎病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的原理、试验条件、试剂或材料、 仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。 本文件适用于猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪血凝性脑脊髓炎病毒 porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV 引 起 猪 血 凝 性 脑 脊 髓 炎 的 病 原 。 PHEV 为 不 分 段 的 单 股 正 链 RNA 病 毒 ， 属 于 冠 状 病 毒 科 （Coronaviridae）、β冠状病毒属（Betacoronavirus）成员。 4 原理 根据PHEV S基因序列设计引物和探针，探针在5’端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端标记TAMRA 作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团 发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥 5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所 吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。 5 5.1 试验条件 生物安全要求 所有培养物和废弃物的处置应符合 GB 19489 规定。 5.2 防污染措施 防止污染措施应符合 GB/T 27401 规定。 1 DB22/T 3283—2021 6 试剂或材料 6.1 M-MLV 反转录酶，浓度为 200 U/μL，-20 ℃ 保存。 6.2 Taq DNA 聚合酶，-20 ℃ 保存。 6.3 RNase 抑制剂，浓度为 40 U/μL，-20 ℃ 保存。 6.4 Oligo（dT）18 引物，浓度为 50 U/μL，-20 ℃ 保存。 6.5 dNTP 混合物，浓度为 2.5 mmol/L，-20 ℃ 保存。 6.6 氯仿，常温保存。 6.7 异丙醇，常温保存。 6.8 75 %乙醇，常温保存，使用前 -20 ℃ 预冷。 6.9 TRIzol 裂解液，常温或 4 ℃ 保存。 6.10 5×MLV 缓冲液 -20 ℃ 保存。 6.11 10×PCR 缓冲液 -20 ℃ 保存。 6.12 阳性对照样品，灭活 PHEV 的细胞培养物，Ct 值≤30。 6.13 阴性对照样品，正常小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a 细胞）、猪肾细胞（PK-15 细胞）等，或者经 检测不含 PHEV 的健康猪脑、脊髓组织研磨液。 6.14 引物和探针见表 1。引物浓度均为 10 mmol/L，-20 ℃ 避光保存，6 个月内使用。 表1 名称 引物和探针序列信息 序列（5’-3’） 上游引物 F CCAGGATAAATTTCTGTGG 下游引物 R AACCAGGACTAACCTTTGC TaqMan 探针（FAM） ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA（TAMRA） 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 冰箱，4 ℃ 冰箱、-20 ℃ 冰箱和 -70 ℃ 超低温冰箱。 高速冷冻离心机，可控温至 4 ℃，离心速度不低于 12 000 r/min。 微量移液器，2 μL、10 μL、50 μL、200 μL 和 1 000 μL。 实时荧光定量 PCR 扩增仪。 组织匀浆仪。 超微量紫外分光光度计。 水浴锅。 离心管，1.5 mL 无 RNase 离心管。 PCR 反应管，根据 PCR 扩增仪要求选择单管、八联排管或 96 孔荧光反应板。 样品 8.1 样品采集 采集疑似猪血凝性脑脊髓炎病死仔猪的脑、脊髓。用灭菌剪刀和镊子剪取待检组织，装入一次性无 菌塑料袋（自封袋），编号，置于冰盒或含有冰袋的保温箱中，密封运送至实验室待检。 2 DB22/T 3283—2021 8.2 样品保存 样品在 2 ℃〜8 ℃ 条件下保存应不超过 24 h，若长期保存应置于 -70 ℃ 超低温冰箱（7.1）中， 且避免反复冻融。 9 9.1 试验步骤 病毒 RNA 提取 9.1.1 称取 1.0 g 待检样品于组织匀浆仪（7.5）中，加入 0.2 mL TRIzol 裂解液（6.9）匀浆，使用 微量移液器（7.3）吸取至 1.5 mL 无 RNase 离心管（7.8）。 9.1.2 另取 2 支 1.5 mL 无 RNase 离心管（7.8），分别加入阳性对照样品、阴性对照样品。 9.1.3 向 9.1.1 和 9.1.2 离心管中加入 1 mL TRIzol 裂解液（6.9），剧烈振荡 15 s，室温静置 10 min。 采用其他等效的 RNA 提取方法，按照试剂盒说明书进行。 9.1.4 加入 200 μL 预冷氯仿（6.6），振荡 15 s，冰上静置 10 min。 9.1.5 4 ℃条件下，高速冷冻离心机（7.2）12 000 r/min 离心 15 min。 9.1.6 使用微量移液器（7.3）吸取上层无色水相于新的 1.5 mL 无 RNase 离心管（7.8）中。 9.1.7 加入等体积预冷异丙醇（6.7），轻轻颠倒混匀，-20 ℃ 条件下静置 30 min。 9.1.8 4 ℃条件下，高速冷冻离心机（7.2）12 000 r/min 离心 10 min，弃上清。 9.1.9 加入 1 mL 预冷的 75 %乙醇（6.8），4 ℃ 条件下，高速冷冻离心机（7.2）12 000 r/min 离心 5 min。 9.1.10 重复 9.1.9 操作一次。 9.1.11 弃上清，滤纸吸干残余液体，室温干燥 2 min。 9.1.12 加入 20 μL 无 RNase H2O 溶解，超微量紫外分光光度计（7.6）测定核酸浓度。冰浴保存备用。 4 ℃ 冰箱（7.1）保存不超过 8 h，长期保存应置于 -70 ℃ 冰箱。 9.2 cDNA 模板制备 按表 2 中各组分依次加入PCR反应管（7.9），盖紧管盖后，瞬时离心 3 s，42 ℃ 水浴锅（7.7） 中水浴 1 h；70 ℃ 水浴锅（7.7）中水浴 10 min；冰浴 2 min，-20 ℃ 冰箱（7.1）保存备用。 表2 反转录系配制表 试剂 用量 RNA模板 1.0 μg Oligo（dT）18引物（100 μmol/L） 1.0 μL 5×MLV缓冲液 4.0 μL dNTP混合物（2.5 mmol/L） 4.0 μL RNase抑制剂（40 U/μL） 0.5 μL M-MLV反转录酶（200 U/μL） 0.5 μL 无RNase H2O 9.3 补至 20.0 μL 反应体系 3 DB22/T 3283—2021 设定 PCR 反应管数≥（n+2）×3，其中 n 为待检样品数，设阳性对照样品（6.12）和阴性对照样 品（6.13）各 1管，每个样品设置 3 次重复反应。按表 3 中各组分依次加入PCR反应管（7.9），盖紧 管盖后，500 r/min瞬时离心 30 s。 表3 PCR反应体系配制表 试剂 用量 10×PCR缓冲液 2.0 μL dNTP混合物（2.5 mmol/L） 2.0 μL 上游引物F（10 mmol/L） 1.0 μL 下游引物R（10 mmol/L） 1.0 μL TaqMan探针（FAM）（10 mmol/L） 1.0 μL cDNA模板 4.0-40.0 ng Taq DNA聚合酶 0.5 μL 无RNase H2O 9.4 补至 25.0 μL 反应参数 将9.3中离心后的PCR反应管（7.9）放入实时荧光定量PCR扩增仪（7.4）内，记录样品摆放顺序。 设定 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PHEV 核酸的反应参数： ——第一阶段，预读 50 ℃ 2 min； ——第二阶段，预变性 95 ℃ 3 min； ——第三阶段，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40 个循环。荧光收集设置在每次循环 60 ℃ 30 s 时 进行。 10 结果判定 10.1 结果分析条件设定 根据收集的 Ct 值判定结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴 性对照样品扩增曲线的最高点为准。 10.2 质控标准 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.2.2 阳性对照 Ct 值≤30，并出现典型的扩增曲线。 10.2.3 如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次试验视为无效。 10.3 结果描述及判定 10.3.1 阴性判定 无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无PHEV核酸，判定为阴性。 10.3.2 阳性判定 Ct 值 ≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在PHEV核酸，判定为阳性。 10.3.3 4 有效原则 DB22/T 3283—2021 10.3.3.1 Ct 值＞35，且出现典型扩增曲线的样品，建议复检。 10.3.3.2 若复检结果仍出现典型扩增曲线，判定为阳性