ICS 67.080.20 CCS B31 43 湖南省 地方 标准 DB 43/T 2812—2023 普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR 法）技术 规程 Code of practice for purity identification of sponge gourd hybrid (SSR method) 2023 - 11 - 09发布 2024 - 02 - 09实施 湖南省市场监督管理局 发布 DB 43/T 2812 —2023 I 目次 前言................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 原理 .............................................................................. 1 4 主要仪器设备、试剂耗材 ............................................................ 1 5 试剂配制 .......................................................................... 2 6 引物 .............................................................................. 2 7 鉴定流程 .......................................................................... 2 8 纯度计算 .......................................................................... 3 附录A（资料性） 常用试剂配方 ........................................................ 5 附录B（资料性） 引物信息 ............................................................ 7 DB 43/T 2812 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件主要起草单位：湖南省蔬菜研究所、长沙市农业科学研究院、长沙县农业局、岳阳市农业科 学研究院，湖南湘妹子农业科技有限公司。 本文件起草人：韩小霞、胡新军、闵子扬、李勇奇、邓稳桥、卢亚楠、刘昆言、粟建文。 DB 43/T 2812 —2023 1 普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR 法）技术规程 1 范围 本文件规定了丝瓜杂交种纯度鉴定的主要仪器设备、试剂耗材、试剂配制、引物、鉴定流程和纯度 计算。 本文件适用于普通丝瓜杂交种纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 3 原理 SSR标记技术是一种以特异引物PCR 扩增为基础的分子标记技术。由于 SSR标记广泛存在于植物基因 组上，不同材料每个位点重复单位的数量及序列可能不同，故而形成扩增片段的长度多态性。根据扩增片段电泳谱带的差异，可鉴定杂交种纯度。 4 主要仪器设备、试剂耗材 主要仪器设备 研钵、镊子、电子天平（精度值为0.001）、高速台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、 PCR 扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、高压灭菌锅、通风柜、胶片观察灯、数码相机、 4 ℃冰箱和 -20 ℃冰箱。 主要试剂 乙二胺四乙酸二钠 （ Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt ，EDTA-2Na ）、盐 酸（HCl）、 氢氧化钠（ NaOH）、三羟甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl) methyl aminomethane ，Tris）】、三 氯甲烷(Chloroform) 、十二烷基磺酸钠（ Sodium dodecyl sulfonate ，SDS）、乙醇（ Ethanol）、异丙 醇（Isopropanol ）、异戊醇（ Isoamyl alcohol）、 Taq DNA聚合酶、 dNTP (dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)、 引物、丙烯酰胺（ Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（ N，N， -methyleme bisacrylamide ）、四甲基乙 二胺（TEMED）、硼酸（ Boric acid ）、过硫酸铵（ Ammonium persulfate ）、硝酸银（ Silver nitrate）、 冰醋酸（ Glacial acetic acid ）、醋酸钠（Sodium acetate）、甲醛（Formaldehyde ）、水（ H2O）符 合GB-T 6682-2016规定。 主要耗材 离心管（ 0.6 ml、 1.5 ml、 2.0 ml）、枪头（白枪头、黄枪头、蓝枪头）、枪头盒、48孔板、96 孔 PCR扩增板、 96孔PCR扩增板管盖、量筒、发芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。 DB 43/T 2812—2023 2 5 试剂配制 相关试剂配制方法见附录 A 6 引物 部分SSR引物信息见附录 B 7 鉴定流程 种子催芽 种子扦样参考 GB/T 3543.2。取丝瓜杂交种约250粒，父母本约各10 粒，温汤浸种后， 28℃～30℃催 芽至种子露出子叶。 取样 取发芽种子胚轴 0.5 cm～1 cm，用于DNA 提取. DNA 提取方法 可采用CTAB小样法或者快速碱煮法提取。 7.3.1 CTAB小样法 将丝瓜样品放于研钵中，加入 0.8 mL DNA缓冲液，研磨均匀，将磨好的样品倒回至 2 ml离心管，冰 上放置或者放冰箱冷冻。 将研磨好的样品放置于 48孔板架上，60 ℃水浴30 min ，中间每隔5 min摇一次，使样品受热均匀。 取出管架，打开 2 mL 离心管管盖，然后加入 0.8 mL氯仿 :异戊醇（ 24:1）溶液，颠倒混匀。室温下静置 5 cm～10 min后10,000 rpm 离心5 min；将上清仔细移至另一 2 mL离心管， 加入1倍体积异丙醇，混匀， 室温静置 3 min，5,000 rpm 离心5 min ，去除上清。 用70%的乙醇洗涤沉淀2 次，待乙 醇全部风干后，加 入500 µL 60 ℃预热的 ddH2O，再加入 5 µL RNaseA(10 µg/µl)，37 ℃温浴10 min ，最后加入1/10 体积 的3 mol/L NaAc及 2×体积的冰乙醇，混匀， -20 ℃放置20 min。 5,000 rpm 离心5 min，去上清，用 70%的乙醇洗涤沉淀 2次，风干乙醇后加入200 µL ddH2O。 用紫外分光光度计检测 DNA浓度并将 DNA溶液用 ddH2O稀释到 20 ng/µL，-20 ℃冰箱中保存备用。 7.3.2 快速碱煮法 将丝瓜胚轴放入 96孔PCR板管底部，并加入 0.25 mol/L 的NaOH溶液50 µL，用96孔板盖盖好PCR板， 置于沸水中煮 3 min，最后加入0.1 mol/L 的Tris﹒HCl (pH=8.0) 150 µL。 PCR 扩增 7.4.1 扩增体系 DNA模板约 0.5 µL，10×Buffer 1 µ L，10 mmol/l dNTP 0.1 µ L，10 pmol/l SSR 引物0.2 µL，2.5 U/µl rTaq 0.1 µL，加灭菌 ddH2O至总体积10 µL。 7.4.2 反应程序