ICS 67.080.10 B31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3032—2016 草莓脱毒种苗生产技术规程 Technical code for the production of virus-free strawberry stock 行业标准信息服务平台 2016-12-23发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3032—2016 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510）归口。 本标准起草单位：沈阳农业大学、北京市农林科学院林业果树研究所、湖北省农业科学院经济作物 研究所。 本标准主要起草人：张志宏、刘月学、张运涛、顾玉成、代红艳、常琳琳、李贺、王桂霞、向发云、马跃 韩永超。 行业标准信息服务平台 NY/T3032—2016 草莓脱毒种苗生产技术规程 1范围 本标准规定了草莓茎尖培养脱毒方法、脱毒种苗保存与繁殖、检测病毒种类和RT-PCR检测方法。 本标准适用于草莓脱毒种苗的培育及草莓活体材料中病毒的检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2. 1 茎尖培养脱毒viruseliminationby shoottipculture 取0.2mm~0.5mm的茎尖，经组织培养获得无病毒植株的过程。 2. 2 脱毒原原种苗breeder'svirus-freestock 通过茎尖培养获得的不携带草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓斑驳病毒且未经过组培增殖的 无病毒原始植株。 2.3 脱毒原种苗originalvirus-freestock 脱毒原原种苗通过匍匐茎繁殖方式繁育出的无病毒植株。 2. 4 脱毒种苗virus-freestock 脱毒原种苗通过匍匐茎繁殖方式繁育出的无病毒植株 3茎尖培养脱毒方法 3.1茎尖剥离及接种 田间选择表现品种特性的健壮植株并做标记。 在匍匐茎发生初期，采集长约2cm的匍匐茎顶端，在超净工作台上去掉外层苞叶，用70%乙醇表面 消毒30s，然后用2%的次氯酸钠溶液消毒10min，再用无菌蒸馏水冲洗3遍。逐层剥去匍匐茎顶端上 的叶原基，用无菌刀片切取0.2mm～0.5mm大小的茎尖，接种在分化培养基上（培养基配方参见附 录A)。 将接种后的培养瓶置于（23土2)℃、光照强度约24001x、每天光照时间14h～16h的培养室中进行 培养。 3.2茎尖分化成苗 茎尖培养2个月后，分化成带有叶原基的小芽，将小芽转接到新鲜的分化培养基上继续培养。 当小芽长出叶片后，将带有叶片的小芽转移到成苗培养基上（培养基配方参见附录A），大约培养2 个月后分化成苗丛。 对苗丛进行编号，然后从苗丛上剪取叶片进行病毒检测，淘汰感染病毒的苗丛，保留无病毒苗丛。 3.3生根和移栽 从脱毒苗丛上剪取株高在2cm以上的试管苗，将试管苗基部的小芽切除，然后接种在生根培养基 中（培养基配方参见附录A）。在组培室中生根培养30d～40d后，将培养容器置于覆盖100目纱网的 1 NY/T3032—2016 温室中，炼苗1周。 炼苗后，用镊子从培养容器中取出生根的试管苗，清除试管苗根部附着的培养基，然后栽人盛有营 养基质的50孔穴盘中，浇透水。营养基质配制方法：将草炭、蛭石、细土、腐熟的牛粪按照5：2：2：1 （体积比）的比例混合，按1kg/m加人氮磷钾（20-5-10）复合肥，混匀，过筛，高温蒸汽消毒，备用。 在穴盘上方搭建塑料小拱棚，塑料薄膜上加盖遮阳网。温度控制在10℃～28℃。移栽后第1周， 空气相对湿度控制在90%以上；移栽后第2周～第6周，空气相对湿度控制在80%以上。通过打开小 拱棚上的薄膜来降低小拱棚中的湿度。移栽6周后撤除小拱上的薄膜。移栽8周后试管苗生长发育成 为可以定植的脱毒原原种苗。 4脱毒原原种苗的保存 网室用100口纱内回建，网室内工具专用，工作人员进人网室前洗手 脱毒原原种苗在网室中保存。 质配餐 3.3的栽植容器中。栽植容 N 器长1m、宽60cm、高 每个俄植 器定植 1株脱毒原 原种百 变 小，观察脱毒原原种苗的 在开花结果期， 勿学性状和生物学 淘汰有变异的植株。 每年春季对脱毒原 原种苗进行一 病毒 测，淘汰感染病毒的植 'RES 5脱毒原种苗的繁殖 S 在网室中脱毒原原种苗 抽生的匍富茎苗即为脱毒原种苗，秋季将脱毒原 苗我植 直于直径10cm的 营养钵中，翌年作为繁苗母 AR R 6脱毒种苗的繁殖 选择地势平地 莓王距 草莓生产园 离直 10km以上的地块 为繁 每667m²施腐享 机肥3 5m、过磷 酸钙30kg。结 以脱原种苗作为母 合 地：耕习粑细尾 做畔， 株，在春季平均 气源 丹株单行定植手鞋 间，株距 认上时将士 7病毒检测 7.1检测病毒种类 包括草莓镶脉病毒 abe nding (Strawberrymild yellow-edgevirus,SMYEV Stra s.SMol errym 7.2检测方法 RNA提取方法参见附录B.RTPCR检测方法参见附录 7.3检测时期和取样部位 M 试管苗和田间苗均可进行病毒检测。取样部位为叶片 一植株设置3次生物学重复。 7.4检测结果判定 将RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后置于凝胶成像仪中观察拍照。凝胶电泳 模式图参见附录C。 检测时设阳性、阴性植株对照，阳性对照植株应扩增出预期大小的单一目的条带，而阴性对照植株 扩不出任何条带。如果样品扩增出与阳性对照位置相同的目的条带，则检测结果呈阳性，即判定该样品 携带病毒。如果样品未扩增出目的条带，则检测结果呈阴性，应进行复检；如果复检结果仍呈阴性，则判 定该样品为无病毒苗。 2 NY/T3032—2016 附录A （资料性附录） 培养基配方 A.1培养基基本成分 如无特殊说明，本标准采用基本培养基均 MS 基 好后置4℃冰箱保 制备培养基 用的母 调节剂溶液配好后 存期最好不超过4个月，如发现 沉淀，则应丢弃 RESE A.2 培养基配方 A.2. 1 基本培养基 MS 用琼脂(6g/L~7g/L) A 固化。 A. 2. 2 培养基 成苗 培养基 焦糖浓度为30g/L，附 ，附加BA0.2mg/LGA0.1mg MS 基之 02mg/L，用琼脂 (6g/ L~ 中固 A.2.3 生根 培养基 1/2MS 本塔 浓度为 1mg/L.用琼脂 (5g/L~6 服务平台 NY/T3032—2016 附录B （资料性附录） RNA提取方法 B.1称取50mg新鲜叶片，放于研钵中，加人液氮后充分研磨。 B.2将磨碎组织转移至1.5mL离心管中（预先加入含2%β-巯基乙醇的500μLCTAB提取缓冲 液），65℃保温20min，期间将离心管颠倒3次～5次，每次大约10s。 B.3加人600μL氯仿/异戊醇（V/V=24：1），轻轻颠倒若干次后4℃、10000r/min离心10min。取 400μL上清液，移人新的1.5mL离心管，然后加人等体积的氯仿/异戊醇（V/V=24：1)，轻轻颠倒 1min，4℃.10000r/min离心10min。 B.4取240μL上清液，加人1/4体积的10mol/LLiCl，颠倒混匀，一20℃放置1h，然后4℃、10000 r/min离心10min。 B.5弃上清液，加人350μLTE缓冲液溶解沉淀，4℃、10000r/min离心10min。 B.6弃沉淀，加人等体积的氯仿/异戊醇（V/V=24：1），轻轻颠倒1min10000r/min离心10min。 B.7将200μL上清液移人新的1.5mL离心管，加人1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，混匀后再 B.8弃上清液，加人500μL70%乙醇洗涤沉淀，共2次。 B.9超净工作台上吹干，用50μLDEPC水溶解沉淀，测定总RNA浓度，立即进行反转录操作或保存 于一70℃超低温冰箱中备用。 行业标准信息服务平台 4 NY/T3032—2016 附录C （资料性附录） RT-PCR检测方法 C.1cDNA合成 在0.2mL离心管中依次加人30ng～50ng总RNA，1μLdNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓 度各为2.5mmol/L），0.5μL随机引物（9-mer）（50μumol/L），0.5μLoligod(T)18（50μmol/L），无菌 超纯水定容至14.5uL。65℃处理5min后取出置于冰上冷却2min。再加入4μuL5×AMV-RT缓冲 液、0.5μuLRNA酶抑制剂（RNasin）、1μLAMV反转录酶，混合均匀后37℃处理2h合成cDNA，然后 70℃处理15min以去除残余酶活性。 C.2PCR扩增 PCR反应混合液共20μL，包括2μLcDNA、2μL10×PCR缓冲液、1.6μLdNTP(dATP、dTTP、 dCTP、dGTP的浓度各为2.5mmol/L）、正向引物（浓度为10μmol/L)0.4μL、反向引物（浓度为10 umol/L)0.4μL(引物序列参见表C.1)、1U热启动TaqDNA聚合酶，用无菌超纯水定容至20μL。 表C.1PCR引物序列及扩增产物大小 病毒名称 引物序列（5-3） 产物，bp 正向引物：GTGTGCTCAATCCAGCCAG 草莓轻型黄边病毒（SMYEV） 271 反向引物：CATGGCACTCATTGGAGCTGGG 正向引物：TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG 草莓斑驳病毒（SMoV) 219 反向引物：TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG 正向引物：GA