ICS 67.080.10 B31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3290—2018 水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的测定 液质联用法 Determination of phenolic acid in fruits, vegetables and derived products- LC-MS-MSmethod 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3290—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部种植业管理司提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC51O）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心（兴 城）、北京农业质量标准与检测技术研究中心。 本标准主要起草人：聂继云、李静、冯晓元、王蒙、闫震、高媛、李志霞、李海飞、匡立学、王瑶。 行业标准信息服务平台 I NY/T3290—2018 水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的测定 液质联用法 1 范围 本标准规定了水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的液质联用测定方法。 本标准适用于水果、蔬菜及其制品中14种主要酚酸的含量测定 本标准的方法检出限和定量限见附录A 2规范性引用文件 RD 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是 日期的 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 GB/T 6682 分析实验室用水规格和 万法 RESE GB/T 8855 新鲜水 果和蔬菜 取样方法 3原理 S 水果、蔬菜及其制品中的酚酸经甲醇提取和碱性水解液提取处理得到游离型 分酸游离酯型酚酸和 结合型酚酸，经固相萃取水柱 净化、超高效液相色谱柱 重四级柱 质谱检测 UR 试剂和材料 除非另有说明 6682 4.1试剂 4.1.1盐酸(HCl) 4. 1. 2 甲酸（HCOOH 色谱 色膳纯 4. 1.3 甲醇（CHO 4. 1. 4 乙睛（CHCN） 4.1.5 氢氧化钠（NaOH） 4. 1. 6 提取剂：甲醇十水 盐酸=80+ 1.3）、200mL水和 0.5mL盐酸（4.1.1），混匀。 4.1.74mol/L氢氧化钠溶液：称取160.0.g氢氧化钠（4.1.5)，用水溶解定容至1000mL。 4.2标准品 14种酚酸标准品：纯度≥98%，相关信息见附录A。 4.3标准溶液配制 4.3.1酚酸标准储备液：称取酚酸标准品10.00mg，用甲醇（4.1.3）溶解并定容至10mL，配制成1 mg/mL的各酚酸标准储备液，在一20℃保存，可使用12个月。 4.3.2酚酸混合标准溶液：根据需要，准确吸取一定量的各酚酸标准储备液，用甲醇（4.1.3）稀释成适 当浓度的混合标准溶液，现用现配。 4.4材料 4.4.1有机相微孔滤膜：0.22μm。 4.4.2 固相萃取小柱：OasisHLB固相萃取小柱，200mg，6mL，或性能相当者。 1 NY/T3290—2018 5仪器 5.1液相色谱仪：配有三重四级杆质谱检测器。 5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g。 5.3离心机：可达到9000r/min以上。 5.4振荡器：带有温度控制。 5.5超声波清洗器。 5.6旋转蒸发仪：带有温度控制。 6试样的制备 水果、蔬菜及其固体制品按GB/T8855的规定取样，四分法取约250g，将可食部分切碎，立即用液 氮冷冻，研磨成粉末，备用。液体果蔬制品直接混匀备用。 7分析步骤 7.1提取 称取10.00g试样于50mL棕色离心管中，加人30mL提取剂（4.1.6），混匀，室温下超声20min， 骤重复提取一次，合并两次提取液，用提取剂（4.1.6）定容至50mL用于游离型酚酸和游离酯型酚酸的 制备，残渣用于结合型酚酸的制备。 7.2酚酸的制备 7.2.1游离型酚酸的制备 吸取10.00mL样品提取液（7.1）于100mL旋转蒸发瓶中，40℃下减压蒸发除去提取液中的有机 溶剂，浓缩至近干，加入2mL水，摇匀，备用，即为溶液A。将固相萃取小柱（4.4.2）依次用约5mL甲 醇（4.1.3）和约5mL水预淋洗、活化，将溶液A加到固相萃取小柱中，缓慢抽滤，滤液需呈滴状，弃去滤 液，用2mL水清洗旋转蒸发瓶，转人固相萃取小柱中，抽滤，弃去滤液，用约5mL甲醇（4.1.3）分两次 清洗旋转蒸发瓶，加入到固相萃取小柱中，收集滤液，用甲醇（4.1.3）定容至5mL，混匀，过滤膜（4.4.1） 待测。 7.2.2游离酯型酚酸的制备 吸取10.00mL样品提取液（7.1）于100mL旋转蒸发瓶中，40℃下减压蒸发除去提取液中的有机 溶剂，浓缩至近干，用10mL4mol/L氢氧化钠溶液（4.1.7）分三次清洗旋蒸瓶，清洗液合并到50mL棕 色离心管，40℃避光振荡水解2h，用盐酸（4.1.1）调节pH至2，混匀，备用，即为溶液B。将固相萃取小 柱（4.4.2）依次用约5mL甲醇（4.1.3）和约5mL水预淋洗、活化，将溶液B加到固相萃取小柱中，抽 （4.1.3）定容至5mL，混匀，过滤膜（4.4.1)待测。 7.2.3结合酯型酚酸的制备 残渣（7.1)用30mL提取剂（4.1.6）分两次清洗后，用20mL4mol/L氢氧化钠溶液（4.1.7)清洗到 50mL棕色离心管中，40℃避光振荡水解2h，离心吸取10mL，用盐酸（4.1.1）调节pH至2为溶液C。 将固相萃取小柱（4.4.2）依次用约5mL甲醇（4.1.3）和约5mL水预淋洗、活化，将溶液C加至固相萃 取小柱中，抽滤，弃去滤液，用约5mL甲醇（4.1.3）分2次清洗固相萃取小柱，加人到固相萃取小柱中， 收集滤液，用甲醇（4.1.3）定容至5mL，混匀，过滤膜（4.4.1）待测。 7.3试剂空白试验 除不加人样品外，其他过程与样品处理相同。 2 NY/T3290—2018 7.4测定 7.4.1液相色谱-串联质谱参考条件 色谱柱：WatersHSST3色谱柱，柱长150mm，内径2.1mm，颗粒度1.8μm，连接同款保护柱或性 能类似的色谱柱。 流速：0.3mL/min。 流动相：A相为0.1%甲酸，B相为乙（含0.1%甲酸），流动相梯度洗脱程序见表1。 表1流动相梯度洗脱程序 时间 流动相 流动相 min B A 0.00 5 0.50 5 5.00 30 9.5 10 15 柱温：40℃。 进样量：5μL ：电喷雾离子 电离源模式： 子模式 电离源极性 租正离子机 R 雾化气：氮气 流速 碰撞气（高纯氩） 离子源温度 15 CENT 脱溶剂气温度 脱溶剂气流量 监测离子对、碰撞 7.4.2定性测定 品检！ 致，并且扣除背 景后的样品质谱图中，所 相一致（表2)， （7.3）甩样进样测定。试剂空自不能检出有 则可判断为该成分。试剂 分有干扰的物质。 各目标化合物的多反应监测（MRM色谐图套见附录 质谱选择离子丰度允许偏差 表2 单位为百分率 相对丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许偏差 ≤±20 ≤±25 7.4.3定量测定 标准采用外标-校准曲线法定量测定。 保证所测样品中组分的响应值均在仪器的线性范围内。 8 结果计算 样品中待测组分的含量以质量分数计，以毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）表示，按式（1）计算。 X=pxV (1) m 3 NY/T3290—2018 式中： X一一试样中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； 一标准曲线计算出试样提取溶液中各组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； P V- 一试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）； 所取试样的量，单位为克（g）或毫升（mL）； 计算结果保留到小数点后两位。 9精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。 在再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 行业标准信息服务平台 NY/T3290—2018 附录A （规范性附录） 各目标化合物的标准物质基本信息及其检出限和定量限 各目标化合物的标准物质基本信息及其检出限和定量限见表A.1。 表A. 1 各目标化合物的标准物质基本信息及其检出限和定量限 序 定量测定范围 检出限 定量限 化合物 CAS号 英文 号 分子式 分子量 μg/ kg μg/ L μg/ kg 1 没食子酸 149-91-7 Gallic acid CH.O 170.12 250~5000 26 250 2 新绿原酸 906-33-2 Neochlorogenic acid CrsHiaOg 354.31 100~2000 24 100 对羟基苯甲酸 99-96-7 4-Hydroxybenzoic acid C,H.O, 138.12 250~5000 30 250 4 绿原酸 327-97-9 Chlorogenic acid CreHisO, 354.31 100~2000 25 100 5 咖啡酸 331-39-5 Caffeic acid C,H.O 180.16 100~2000 19 100 6 香草酸 121-34-6 Vanillic acid C,H.O 168.15 250~5000 34 250 7 丁香酸 530-57-4 Syringic acid C,HoOs 198.17 250~5000 28 250 8 对香豆酸 4501-31-9 C,H.O Cinnamic acid 164.16 100~2000 15 100 9 阿魏酸 113