I ICS 13.060.01 CCS Z 17 团体 标准 T/PSC 1.5—2022 船舶压载水检测方法 第5部分：霍乱弧菌 Ballast water detection method for ships —— Part 5: Vibrio cholerae 2022-01-01发布 2022-07-01实施 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.5-2022 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ................ 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ...... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ .......... 1 4 方法原理 ................................ ................................ ............ 1 5 试剂 ................................ ................................ ................ 1 6 仪器及设备 ................................ ................................ .......... 2 7 样品处理方法 ................................ ................................ ........ 3 8 菌株鉴定 ................................ ................................ ............ 3 9 毒力基因检测 ................................ ................................ ........ 4 10 检测结果报告 ................................ ................................ ....... 4 参考文献 ................................ ................................ .............. 5 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.5-2022 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本部分为 T/PSC 1—2021《船舶压载水检测方法》的第 5部分，T/PSC 1—2021已经发布了以下部分： ——船舶压载水检测方法 第1部分：大于等于 50 μm活体生物； ——船舶压载水检测方法 第2部分：大于等于 10 μm且小于50 μm活体生物； ——船舶压载水检测方法 第3部分：大肠埃希氏菌； ——船舶压载水检测方法 第4部分：肠道球菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国太平洋学会东海环境分会提出。 本文件由中国太平洋学会归口。 本文件起草单位：上海海洋大学、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局东海标准计量中心。 本文件主要起草人：吴惠仙、王琼、薛俊增、王腾、袁林、徐超群、何勇。 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.5-2022 1 船舶压载水检测方法 第5部分：霍乱弧菌 警告：霍乱弧菌为致病微生物，应 在相应级别的 生物安全实验室中检测，操作时应按照要求佩戴生 物防护用品，注意实验废弃物的生物消毒。 1 范围 本文件规定了分离培养法检测船舶压载水中霍乱弧菌的方法原理、试剂和材料、仪器和设备、样品 处理、菌株鉴定、毒力基因检测和检测结果报告。 本文件适用于应用分离培养法检测船舶压载水中的霍乱弧菌。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本 文件。 WS 289-2008 霍乱诊断标 准 IMO MEPC.300(72) ：2018 压载水管理系统认可规则（ Code for approval of ballast water management systems (BWMS CODE) ） IMO BWM.2/Circ.42 ：2015 压载水取样和分析试用指南（ G2导则）（ Guidance on ballast water sampling and analysis for trial use in accordance with the B WM Convention and Guidelines(G2) ） 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 方法原理 使用碱性蛋白胨水对样本中霍乱弧菌进行选择性增菌， 再利用 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培 养基（TCBS）和弧菌显色培养基 分离纯化霍乱弧菌，进而进行生化鉴定。最后通过分子生物学方法检测 霍乱毒素 基因。 5 试剂 改良营养琼脂培养基 5.1 按下列成分混匀后，调至 pH值为7.0～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌 20min。也可用市场上销售的可替 代产品。具体成分如下： ——牛肉浸膏， 5 g； ——蛋白胨， 3 g； ——氯化钠， 10 g； ——琼脂，15 g； ——蒸馏水， 1000 mL。 碱性蛋白胨水（ APW） 5.2 按下列成分加热搅拌至溶解，调至 pH值为8.4～8.8，121 ℃高压蒸汽灭菌 20min。也可用市场上销 售的可替代产品。具体成分如下： ——蛋白胨， 10 g； ——氯化钠， 10 g； 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.5-2022 2 ——蒸馏水， 1000 mL。 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基 (TCBS) 5.3 将下列成分混合加热煮沸， 调至 pH值为8.6～8.8， 不要高压灭菌。 也可用市场上销售的可替代产品。 具体成分如下： ——酵母浸粉， 5 g； ——蛋白胨， 10 g； ——硫代硫酸钠， 10 g； ——柠檬酸钠， 10 g； ——牛胆盐， 8 g； ——蔗糖，20 g； ——氯化钠， 10 g； ——柠檬酸铁， 1 g； ——麝香草酚蓝， 0.04 g； ——溴麝香草酚蓝， 0.04 g； ——琼脂，18 g； ——蒸馏水， 1000 mL。 弧菌显色培养基 5.4 将各下列成分混合加热煮沸， 调至pH值为6.7～7.1，不要高压灭菌。也可用市场上销售的可替代产 品。具体 成分如下： ——蛋白胨和酵母粉 ，8.0 g； ——盐类，51.4 g； ——色素，0.3 g ——琼脂，11 g； ——蒸馏水， 1000 mL。 磷酸缓冲溶液（ PBS） 5.5 按以下比 例配置，摇匀后 121 ℃高压蒸汽灭菌 20min，放凉备用 。具体配置比例如下： ——磷酸二氢钠（ NaH2PO4），6.9 g； ——氢氧化钠（ NaOH）（0.1 mol/L），3 mL； ——水，补足至， 50 mL。 6 仪器及设备 恒温培养箱：能够恒温至 30 ℃～37 ℃。 6.1 高压蒸汽灭菌器：能够加热至 121 ℃。 6.2 抽滤泵。 6.3 离心机：转速不大于 30000 r/min。 6.4 二级生物安全柜 。 6.5 过滤膜（直径 47 mm，孔径0.22 μm）。 6.6 无菌 滤膜专用镊子 。 6.7 三角瓶： 150 mL。 6.8 接种环。 6.9 无菌培养皿 。 6.10 全国团体标准信息平台 T/PSC 1.5-2022 3 移液管、样品瓶、三角瓶 和离心管等玻璃器皿和采样器具应按无菌操作要求包扎，于 121 ℃高 6.11 压蒸汽灭菌 20min，烘干，备用。如容器不能经受高压灭菌，应在高于 70 ℃的流动热水或流动蒸汽中 处理至少 5min。灭菌后的采样瓶，两周内未使用，应重新灭菌。 7 样品处理方法 样品采集 7.1 7.1.1 按照IMO MEPC.300(72) ：2018与IMO BWM.2/Circ.42 ：2015的相关规定进行样品采集。采样结 束后，水样应 10 ℃～15 ℃运输， 24h内完成检测。 7.1.2 在采样现场测定并记录水样盐度。盐度的测定按 GB/T 17378.4