(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211523943.3 (22)申请日 2022.12.01 (71)申请人 山东大学 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路44号 (72)发明人 梁晓红　焦德雁　桑元华　郝敏　 马春红　高立芬　李春阳　岳学田　 武专昌　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 专利代理师 王志坤 (51)Int.Cl. A61K 35/17(2015.01) A61K 9/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61K 38/19(2006.01) A61K 39/395(2006.01) (54)发明名称 一种i-CS/HAp-NK复合体及其制备方法和应 用 (57)摘要 本发明属于材料合 成和生物医药技术领域， 具体涉及一种i ‑CS/HAp‑NK复合体及其制备方法 和应用。 本发 明分别利用细胞因子和抗体修饰羟 基磷灰石纳米线， 得到细胞因子修饰的羟基磷灰 石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线； 将细 胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的 羟基磷灰石纳米线混合， 与NK细胞共培养， 离心 后使用PBS重悬获得沉淀， 与温敏水凝胶溶液混 匀， 得到i ‑CS/HAp‑NK复合体。 i ‑CS/HAp‑NK复合 体可实现NK细胞缓释、 激活， 体内外实验证实具 有良好的抗肿瘤能力， 有望为应用于实体肿瘤的 治疗。 权利要求书1页 说明书7页 附图7页 CN 115531415 A 2022.12.30 CN 115531415 A 1.一种i‑CS/HAp‑NK复合体的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 分别利用细胞因子和抗体修饰羟基磷灰石纳米线， 得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳 米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线； 将细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线按质量比1:1 ‑3 混合， 与NK细胞共培养36 ‑60 h， 离心后使用PBS重悬获得沉淀， 与温敏水凝胶溶液混匀， 置 于36‑37℃， 得到i ‑CS/HAp‑NK复合体。 2.如权利要求1所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制 备方法， 其特征在于， 所述羟基磷灰石 纳米线的制备 方法为： 将NaOH、 CaCl2和NaH2PO4·2H2O依次加入到 水和乙醇的混合物中， 加热， 冷却到室温后离 心得到所述羟基磷灰石纳米线。 3.如权利要求2所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制备方法， 其特征在于， NaOH的质量为 0.3‑0.8g， CaCl2的质量为0.1‑0.2g， NaH2PO4·2H2O的质量为0.15‑0.3g； 加热温度为20 0‑250℃， 加热时间为3 6‑60h。 4.如权利要求1所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制 备方法， 其特征在于， 所述细胞因子修 饰的羟基磷灰石纳米线的制备 方法为： 将羟基磷灰石纳米线用PBS溶液重悬， 加入细胞因子后， 置于四度摇床10 ‑14h， 离心重 悬后得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线； 所述细胞因子为 IL‑2、 IL‑21中的一种或多种。 5.如权利要求1所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制 备方法， 其特征在于， 所述抗体修饰的 羟基磷灰石纳米线的制备 方法为： 羟基磷灰石纳米线与3 ‑氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇的水溶液中混合， 将混合物的pH 值调节到9 ‑11， 搅拌离心后得到氨基化的羟基磷灰石纳米线； 氨基化的羟基磷灰石纳米线与EDC和Sulfo ‑NHS溶液在pH值为 中性的条件下孵育30min 之后， 将抗体加入混合物中孵 育， 得到抗体修饰的羟基磷灰石纳米线； 所述抗体为α‑NKG2D、 α‑4‑1‑BB中的一种或多种。 6.如权利要求1所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制 备方法， 其特征在于， 所述温敏水凝胶 溶液的制备 方法： 将壳聚糖溶 液与β‑甘油磷酸钠溶 液在冰浴中混合， 得到所述温敏 水凝胶溶 液。 7.如权利要求6所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制 备方法， 其特征在于， 所述壳聚糖溶液 通过壳聚糖溶于 0.1M醋酸溶 液得到， 所述壳聚糖溶 液的质量浓度为1 ‑3%； 所述β‑甘油磷酸钠溶液为β ‑甘油磷酸钠的水溶液， 所述β ‑甘油磷酸钠溶液的质量浓度 为40‑60%； 所述壳聚糖溶 液和β‑甘油磷酸钠溶 液的体积比为 4:1‑6:1。 8.如权利要求1所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体的制 备方法， 其特征在于， 细胞因子修饰的 羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线的质量比为1:2； 共培 养时间为 48h。 9.一种i‑CS/HAp‑NK复合体， 其特征在于， 由权利要求1 ‑8任一项所述的i ‑CS/HAp‑NK复 合体的制备 方法获得。 10.权利要求9所述的i ‑CS/HAp‑NK复合体在制备治疗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115531415 A 2一种i‑CS/HAp‑NK复合体及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于材料合成和 生物医药技术领域， 具体涉及一种i ‑CS/HAp‑NK复合体及 其制备方法和应用。 背景技术 [0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003]近年来,肿瘤发病率呈现持续上升的态势,死亡率居高不下。 临床上一般采用包括 手术治疗、 放疗、 化疗等的综合治疗方案。 随着对癌症发病机制的深入了解， 免疫治疗已成 为肿瘤综合治疗的重要手段之一。 目前， 过继免疫细胞治疗、 免疫检查点分子等多种免疫治 疗方法在临床研究得到肯定， 成为肿瘤治疗有潜力的新领域。 [0004]自然杀伤 （Natural  killer， NK） 细胞是一种很有前途的癌症免疫治疗工具。 NK细 胞是天然免疫系统的重要组成部分， 也是肿瘤 免疫监测的关键。 NK细胞通过细胞毒途径和 产生细胞因子直接杀伤肿瘤细胞， 杀伤作用更快更强， 产生持续的抗肿瘤免疫反应。 肿瘤中 低氧、 低营养的微环境导致NK细胞功能耗竭、 数目减少， 与肿瘤的发展密切相关。 目前多数 临床研究将NK细胞免疫疗法集中于血液瘤， 而在实体瘤临床 研究中NK细胞过继转输治疗效 果并不理想。 因此， 开发一种能够提升肿瘤微环境中NK细胞存活能力和效应功能的策略和 方案将具有重要的临床应用价 值。 [0005]NK细胞的效应功能依赖于NK细胞活化信号和 抑制信号之间的平衡。 活化受体是调 节NK细胞功能的关键因素， 其中NKG2D和4 ‑1BB是NK细胞上主要的活化受体之一。 细胞因子 也在NK细胞激活、 成熟和增殖中发挥重要作用， 例如， IL ‑21可以促进NK细胞的激活， IL ‑2用 于维持NK细胞的存活。 因此， 基于NK细胞表面的活化性受体和细胞因子设计联合激活NK细 胞有望为实体瘤治疗提供新策略。 发明内容 [0006]为了解决现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种i ‑CS/HAp‑NK复合体及其制 备方法和应用。 本发明基于羟基磷灰石纳米线的细胞因子吸 附能力和抗体结合性能， 联合 温敏水凝胶在体内的缓释优势， 制备了一种可实现NK细胞缓释、 激活的i ‑CS/HAp‑NK复合 物， 体内外实验证实具有良好的抗肿瘤能力， 有望为应用于实体肿瘤的治疗。 [0007]为了实现上述目的， 本发明是通过如下的技 术方案来实现： 第一方面， 本发明提供了一种i ‑CS/HAp‑NK复合体的制备 方法， 包括以下步骤： 分别利用细胞因子和抗体修饰羟基磷灰石纳 米线， 得到细胞因子修饰的羟基磷灰 石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线； 将细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线按质量比 1:1‑3混合， 与NK细胞共培养36 ‑60 h， 离心后使用PBS重悬获得沉淀， 与温敏水凝胶溶液混说　明　书 1/7 页 3 CN 115531415 A 3