(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211087400.1 (22)申请日 2022.09.07 (71)申请人 福建农林大 学 地址 350002 福建省福州市仓山区上 下店 路15号 (72)发明人 邱君志　朱志强　谭震　杨晨杰　 陈金慧　刘森　陈宇熹　蒲慧丽　 任冠儒　赵杰　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12P 33/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 11/00(2006.01)A61K 31/56(2006.01) C07J 63/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备 方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种Raffaelea  lauricola次 级代谢产物的制备方法及其应用， 包括： 活化菌 株， 初级培养， 次级培养， 菌体研磨， 乙酸乙酯萃 取， 浓缩得粗提物， 将粗提物进行反相硅胶柱层 析， 以甲醇： 水梯度洗脱， 再通过多次200 ‑300目 硅胶柱层析纯化， 收集洗脱液浓缩， 得到目标产 物。 经1H NMR、13C NMR、 COSY、 HMBC、 HSQC谱图分析 证明A'‑Neogammacer ‑21‑en‑15α‑ol首次在该 菌种代谢物中提取到 。 权利要求书1页 说明书3页 附图6页 CN 115323028 A 2022.11.11 CN 115323028 A 1.Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备 方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 1） 将Raffaelea  lauricola 活化后， 取菌块接种到PDB培养基中， 在160～180  r/min、 20 ~28℃条件下连续培养5~10天， 按15wt%~20wt%接种量转接到大米培养基中， 继续在20～28 ℃条件下静置 培养28～40天得到 菌丝体； 2） 将步骤1） 得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状， 用1~2倍体积的乙酸乙酯浸 泡12~24小时， 超声40~60分钟， 收集萃取液， 残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯， 超 声40~60分钟， 收集萃取 液重复以上步骤， 共得到三份萃取 液合并浓 缩得到粗 提物浸膏； 3） 将粗提物浸膏用氯仿 或二氯甲烷溶解， 然后用反相硅胶C18进行拌样， 干法装柱， 以甲 醇： 水体积比1:9 ‑9:1梯度洗脱， 收集甲醇： 水体积比为9:1部分洗脱液， 旋蒸浓缩获得组分 A； 4） 用1倍体积的氯仿溶解组分A， 过200 ‑300目硅胶柱， 石油醚： 乙酸乙酯体积比为30:1 开始梯度洗脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液， 旋蒸浓缩得浸膏， 再过 200‑300目硅胶柱， 以石油醚： 氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱， 收集石油醚:氯仿体积比为 4:1部分洗脱液， 再过200 ‑300目硅胶柱层析， 以石油醚： 乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗 脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液， 旋蒸 得到白色粉末状A' ‑Neogammacer ‑ 21‑en‑15α‑ol， 即藿烷型三萜类化 合物。 2.根据权利要求1所述的 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物的制备方法， 其特征在 于： 步骤1） 中大米培养基组成为： 大米100  g,木屑10  g,加入纯水120  mL； 经121℃高压灭菌 20 min后使用。 3.根据权利要求1所述的 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物的制备方法， 其特征在 于： 步骤1） 中菌块的大小为0.5 ×0.5 cm， 接种量 为4块。 4.根据权利要求1所述的 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物的制备方法， 其特征在 于： 步骤2） 中超声的功率 为400 W， 频率为35 KHz。 5.根据权利要求1所述的 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物的制备方法， 其特征在 于： 步骤3） 中使用的反相硅胶C18粒径40‑60 μm， 孔径120   Å。 6.根据权利要求1所述的 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物的制备方法， 其特征在 于： 步骤3） 中梯度洗脱比例为甲醇： 水体积比1:9,  2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1。 7.根据权利要求1所述的 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物的制备方法， 其特征在 于： 步骤4） 中梯度洗脱中石油醚： 乙酸乙酯体积比依次为30:1,  20:1, 10:1, 7:1, 5:1， 石 油醚： 氯仿体积比依次为8 :1, 6:1, 4:1。 8.一种如权利要求1 ‑7任一项所述的制备方法制得的Raffaelea  lauricola次级代谢 产物在抑制人乳腺癌肿瘤 细胞MCF‑7增殖的药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115323028 A 2Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于从菌株分离活性物质的技术领域， 具体涉及 Raffaelea  lauricola 次 级代谢产物 （藿烷型三萜 类化合物A' ‑Neogammac er‑21‑en‑15α‑ol） 的制备方法及其抑制人 乳腺癌细胞株M CF‑7的新用途。 背景技术 [0002]Raffaelea  lauricola是食菌小蠹 （ Ambrosia  beetle） 携带的高致病性伴生真菌， 是导致树木枯萎病的病原真菌， 学者们长期致力于研究其致病机理， 伴 随着研究的持续深 入， 已在该属其他物种中获得一些抑制植物生长、 抗菌等活性物质。 这预示该菌在生物农药 或医药上潜在极大应用价 值。 [0003]A'‑Neogammacer ‑21‑en‑15α‑ol是藿烷型三萜类物质， 而藿烷型三萜类物质多具 有抗肿瘤、 抗炎、 抗菌等活性。 可以修饰A' ‑Neogammacer ‑21‑en‑15α‑ol的化学结构进而生 成各种新的活性物质。 到目前为止， 尚未发现在 Raffaelea  lauricola 中分离到A' ‑ Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的报道。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种 Raffaelea  lauricola 次级代谢产物及其抑制人乳腺癌 细胞株MCF ‑7的新用途， 所述代谢产物为： 藿烷型三萜类化合物A' ‑Neogammacer ‑21‑en‑15 α‑ol。 [0005]所述Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备 方法， 采取的技 术方案如下： 1)将Raffaelea  lauricola 活化后， 取菌块接种到PDB培养基中， 在， 在140～180   r/min、 20~28℃条件下连续培养5~10天， 按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基 中， 继续在20～ 28℃条件下静置 培养28～40天， 得到 菌丝体。 [0006]2） 将步骤1） 得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎， 用1~2倍体积的乙酸乙酯浸 泡12~24小时， 超声40~60分钟， 收集萃取液， 残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯， 超 声40~60分钟， 收集萃取 液， 重复以上步骤， 共得到三份萃取 液合并浓 缩得到粗 提物浸膏。 [0007]3） 将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解， 然后用反相硅胶C18进行拌样， 干法装柱， 以甲 醇： 水体积比1:9 ‑9:1梯度洗脱， 收集甲醇： 水体积比为9:1部分洗脱液， 旋蒸浓 缩得组分A。 [0008]4） 用1倍体积的氯仿溶解 组分A， 过200 ‑300 目硅胶柱， 石油醚： 乙酸乙酯体积比为 30:1 开始梯度洗脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱 液， 旋蒸浓缩 得浸膏， 再 过200‑300目硅胶柱， 以石油醚： 氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱， 收集石油醚:氯仿体积比 4:1部分洗脱液， 再过200 ‑300目硅胶柱层析， 以石油醚： 乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗 脱， 收集石油醚： 乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液， 旋蒸 得到白色粉末状A' ‑Neogammacer ‑ 21‑en‑15α‑ol， 其结构式如下 所示：说　明　书 1/3 页 3 CN 115323028 A 3