(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211082924.1 (22)申请日 2022.09.06 (71)申请人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92号 (72)发明人 李英奇　崔继成　 (74)专利代理 机构 山西五维专利事务所(有限 公司) 1410 5 专利代理师 张福增 (51)Int.Cl. A61K 47/60(2017.01) A61K 47/52(2017.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 9/52(2006.01)A61K 47/10(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 47/20(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 31/11(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 pH响应释药的双药纳米钻石药物及其制备 方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种pH响应释药的双药纳米 钻石药物及其制备方法和应用。 所述药物的制 备： 首先， 将全反式视黄醛(ATR)， 即全反式视黄 酸的前体， 与胱胺二盐酸盐通过亚胺键形成胱胺 化的全反式视黄 醛(ASS)， 然后进 一步与PEG修饰 的纳米钻石(ND)生成ND ‑PEG‑ASS(NPA)纳米药 物， 该纳米药物经物理吸附阿霉素(DOX)， 形成双 药纳米药物ND ‑PEG‑ASS@DOX(NPA@D)。 体外药物 释放实验表明， 这是一种对pH敏 感的药物 递送系 统。 细胞毒 性结果表明， NPA@D纳米药物能够抑制 DOX敏感的MCF ‑7和具有DOX耐药性的MCF ‑7/ADR 细胞生长。 更重要的是， 与NP@D相比， NPA@D纳米 药物以协同方式更有效地抑制细胞活力和迁移。 此外， NPA@D纳米药物能够阻止耐药肿瘤细胞膜 上过表达的P ‑gp糖蛋白泵出化疗药物， 从而逆转 耐药MCF‑7/ADR细胞的耐药性。 权利要求书1页 说明书10页 附图8页 CN 115444941 A 2022.12.09 CN 115444941 A 1.一种pH响应释药的双药纳米钻石药物的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)称取5 ‑10mg真空干燥的羧基化纳米钻石(ND ‑COOH)， 加入适量浓度0.1M、 pH5.8的 MES缓冲液， 超声分散20 ‑30min， 然后称取1.0 ‑2.0mg 1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺 盐酸盐(EDC)和1.2 ‑2.5mg N‑羟基丁二酰亚胺(NHS)， 依次加入上述分散体系中， 室温下匀 速搅拌反应5 ‑8h， 待反应结束后， 离心去除上清液， 并用浓度0.1M、 pH  8.4的BBS缓冲液进行 洗涤， 之后迅速加入适量相同的BBS缓冲液， 超声分散20 ‑30min， 然后加入8mg ‑10mg氨基 ‑聚 乙二醇‑羧基， 室温搅拌反应过夜。 待反应结束， 离心并用蒸馏水洗涤， 得到产物ND ‑PEG‑ COOH(NP)， 冷冻干燥备用； (2)称取25 ‑35mg的全反式视黄醛(ATR)， 加入少量无水甲醇溶解， 然后称取其3倍摩尔 量的胱胺 二盐酸盐溶于3 ‑5mL无水甲醇， 待完全 溶解后， 置于磁力搅拌器上进行搅拌， 将ATR 溶液慢速滴入， 氮气氛围保护， 在40℃油浴条件 下反应20 ‑30h； 反应结束后， 旋蒸除去溶剂， 得到产物ATR ‑H2N‑CH2‑CH2‑S‑S‑CH2‑CH2‑NH2(ASS)， 加入DMS O， 将产物溶解， 之后置于冰箱， 在‑20℃保存； (3)称取5‑10mg上述制备好的ND ‑PEG‑COOH(NP)， 加入适量浓度 0.1M、 pH 5.8的MES缓冲 液， 进行超声分散2 0‑30min， 然后称取 1.0‑2.0mg EDC和1.2 ‑2.5mg NHS， 依次加入上述 分散 体系中， 室温下匀速搅拌反应5 ‑8h， 待反应结束后， 离心并用浓度0.1M、 pH  8.4的BBS缓冲液 进行洗涤； 之后加入适量相同的BBS缓冲液进行超声分散20 ‑30min， 置于磁力搅拌器上， 在 快速搅拌的状态下， 逐滴加入 上述制备的ASS， 室温条件 下反应20 ‑30h； 反应结束后， 离心收 集上清液， 然后固体用无水乙醇洗涤至上清液无色， 真空干燥固体样品得到NP ‑H2N‑CH2‑ CH2‑S‑S‑CH2‑CH2‑NH2‑ATR(NPA)， 待干燥完成后称取5 ‑8mg， 加入5 ‑8mL浓度1.0M的Na3Cit缓 冲液， 超声分散20 ‑30min， 然后加入1.0 ‑2.0mg DOX， 室温避光搅拌5 ‑8h， 反应结束后， 离心 收集上清液， 并用蒸馏水洗涤至上清液无色， 收集洗涤液， 将得到的NP ‑H2N‑CH2‑CH2‑S‑S‑ CH2‑CH2‑NH2‑ATR@DOX(NPA@D)冷冻干燥， 避光保存。 2.如权利要求1所述方法制备 得到的pH响应释药的双药纳米钻石药物。 3.如权利要求2所述的pH响应释药的双药纳米钻石药物在制备抗肿瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115444941 A 2pH响应释药的双药纳米钻石药物及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及纳米钻石药物， 特别涉及pH响应释药的双药纳米药物， 具体属于一种 先共价连接胱胺化的全反式视黄醛， 然后物理吸附阿霉素的pH响应型双药纳米钻石 药物及 其制备方法， 以及该 药物在抗肿瘤中的应用。 背景技术 [0002]在最新的癌 症统计数据中， 乳腺癌已超越肺癌， 成为全球第一大癌， 据统计2020年 有225万的乳腺癌新增病例和68万的死亡人数， 是女性健康的第一杀手。 阿霉素(DOX)是 目 前临床上广泛应用治疗乳腺癌的化疗方法， 然而阿霉素对癌细胞 的特异性低， 尤其是对心 脏的毒性限制了它的大剂量使用。 此外， 治疗预后效果差， 易造成癌症复发、 转移和耐药。 联 合化疗可通过调节癌症的不同信号通路来克服耐药性， 最大限度地发挥治疗作用， 已经引 起了广泛的关注。 因此， 如何将其它化疗 药物与DOX结合， 提高化疗效果， 减少副作用引起研 究人员的广泛兴趣。 [0003]针对这个问题， 将两种药物同时集于一种给 药系统是一个不 错的选择。 [0004]全反式视黄醛(ATR)是全反式视黄酸的前驱体， 能在溶酶体中被氧化为全反式视 黄酸(ATRA)， 但ATRA水溶性很差， 限制了它的广泛使用。 ATRA是一种维生素A衍生物， 常用于 临床治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)。 ATRA还是一种强大的分化剂， 抑制普通癌细胞增 殖， 诱导恶性细胞分化， 通过阻碍参与干细胞维持的多种信号通路来 发挥作用。 还可以作为 一种细胞衰老剂来预防和抑制许多癌恶性肿瘤的生长。 研究表明， ATRA可以增强化疗药物 的细胞毒性， 例如已被证明可以增加鳞状头颈部癌和卵巢癌细胞对顺铂的体外敏感性， 类 视黄酸和细胞毒性药物联合使用也增强了疗效。 [0005]共传递纳米药物输送体系是将不同的药剂装载于同一纳 米颗粒中， 达到协同治疗 的效果。 前期研究证明， 纳米钻石具有良好的生物相容性， 表面易修饰， 可通过物理吸 附和 共价连接的方式负载各种化疗药物， 减少化疗药物的泄露。 此外， 纳米钻石能对化疗药物进 行缓释， 逆转肿 瘤细胞的耐药性。 受之前实验的启发， 为了 改善全反式视黄醛(ATR)的水溶 性， 我们通过可与肿瘤微酸环境响应的亚胺键将全反式视黄醛进行胱胺化， 然后与聚乙二 醇修饰的纳米钻石进行共价连接， 之后在 Na3Cit介质中将DOX负 载， 最终形成pH敏感的双药 纳米药物体系， 并研究了该 药物在肿瘤 细胞内的释药及抗肿瘤效应。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种胱胺化的全反式视黄醛与PEG化的纳 米钻石进行共价 连接， 并物理吸附阿霉素， 获得pH 响应释药的双药纳米钻石靶向药物及其制备方法， 以及该 药物在抗肿瘤中的应用。 [0007]本发明提供的一种pH响应释药的双药纳米钻石药物的制备 方法， 包括如下步骤： [0008](1)称取5 ‑10mg真空干燥的羧基化纳米钻石(ND ‑COOH)， 加入适量的MES缓冲液 (0.1M， pH  5.8)， 超声分散20 ‑30min， 然后称取1.0 ‑2.0mg 1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳二说　明　书 1/10 页 3 CN 115444941 A 3